[发明专利]建立斑马鱼血栓模型的方法及筛选抗栓/致栓药物的方法

权利要求书

1.一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，所述的方法包括下述步骤：

（1）斑马鱼选取

选取受精后2-4天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中；

（2）化合物处理

移除微孔板中的养殖用水，然后按照血栓诱导剂处理组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的血栓诱导剂溶液、溶剂、养殖用水，接着将微孔板于28℃下恒温培养24-48小时，其中，血栓诱导剂溶液为浓度为10mM-30mM的苯肼溶液，溶剂为浓度为0.1%的酒精，

（3）荧光显微镜定性分析或/和定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，所述的荧光显微镜定性分析按照下述方法操作：

移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入浓度为0.64mM的甲磺酸麻醉斑马鱼，然后用3%甲基纤维素胶固定于双凹载玻片上，接着置于荧光显微镜下观察斑马鱼尾静脉血栓形成情况。

3.根据权利要求1所述的一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，所述的定量分析按下述步骤操作：

移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入邻联茴香胺染色液，然后将微孔板置于28℃恒温培养10-15min；接着移除染色液，用DMSO快速清洗数遍，将斑马鱼转入新的微孔板中，根据微孔板规格加入DMSO；再将斑马鱼侧位放置于双凹载玻片上，最后置于荧光显微镜下对心脏部位进行拍照并保存，再利用图像处理软件进行图像分析，计算心脏红细胞染色强度，血栓形成率计算公式如下：

。

4.根据权利要求3所述的一种建立斑马鱼血栓模型的方法，其特征在于，所述的邻联茴香胺染色液组成为含0.6mg/mL邻联茴香胺、0.01M醋酸钠、0.65%H₂O₂、40%酒精。

5.一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，其特征在于，所述的方法包括下述步骤：

（1）斑马鱼选取

选取受精后2-4天的正常发育的斑马鱼，放入微孔板中；

（2）化合物处理

A方案：移除微孔板中的养殖用水，然后按照待测化合物组合处理组、血栓模型组、阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的血栓诱导剂溶液+0.1-1000μM待测化合物溶液、血栓诱导剂溶液、血栓诱导剂溶液+0.1-1000μM抗血栓药物溶液、溶剂、养殖用水，接着将微孔板于28℃下恒温培养24-48小时，其中，血栓诱导剂溶液为浓度为10mM-30mM的苯肼溶液，溶剂为浓度为0.1%的酒精，或者

B方案：移除微孔板中的养殖用水，然后按照待测化合物处理组、血栓形成阳性对照组、溶剂对照组、空白对照组，根据微孔板的规格分别加入相应的0.1-1000μM待测化合物溶液、血栓诱导剂溶液、溶剂、养殖用水，接着将微孔板于28℃下恒温培养24-48小时，其中，血栓诱导剂溶液为浓度为10mM-30mM的苯肼溶液，溶剂为浓度为0.1%的酒精，

（3）荧光显微镜定性分析或/和定量分析。

6.根据权利要求5所述的一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，其特征在于，所述的A方案中：待测化合物组合处理组的加入采用同时添加的方式或者加入血栓诱导剂苯肼6-24h后再加入待测化合物溶液的方式或者加入待测化合物溶液6-24h后再加入血栓诱导剂。

7.根据权利要求5所述的一种建立斑马鱼血栓模型筛选抗栓/致栓药物的方法，其特征在于，所述的荧光显微镜定性分析按照下述方法操作：

移除微孔板中的液体，根据微孔板规格加入浓度为0.64mM的甲磺酸麻醉斑马鱼，然后用3%甲基纤维素胶固定于双凹载玻片上，接着置于荧光显微镜下观察斑马鱼尾静脉血栓形成情况。