[发明专利]建立斑马鱼血栓模型的方法及筛选抗栓/致栓药物的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物筛选（评价）领域，具体涉及一种简便、经济、快速、高效、高通量的斑马鱼血栓模型的建立方法，并且利用该动物模型筛选抗血栓药物和评价药物的致血栓性。

背景技术

血栓性疾病是一种血管内腔狭窄与闭塞引发的常见心脑血管病。血栓形成是造成脑卒中、冠心病、动脉粥样硬化等致残和致死率高的心脑血管疾病的主要病理基础。动脉血栓形成初期主要由血管内皮受损，血小板黏附和聚集所致，而静脉血栓一般由血流缓慢或瘀滞引起^[1]。

随着人类生活环境和膳食习惯的变化，心、脑血管病的发病率和死亡率正逐年增高。据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年平均有1700万人被心脑血管病夺走生命，占了世界总死亡人数的30%。我国是脑卒中高发病率国家，每年由高血压引致的脑血栓多达120万人，存活者中有75%的患者因病致残，40%以上为重度致残。

据《2009-2010年中国抗血栓药市场研究分析预测报告》指出，抗血栓药物是年销售额数十亿美元的大市场，预计到2015全球新颖抗血栓药物创造的市场总价值将达到100亿美元左右。德国拜尔和法国赛诺菲-安万特引领抗血栓药物的市场，拜尔新药Rivaroxaban在2008年面市，成为凝血因子Xa抑制剂类的第一新药^[2]。百时美施贵宝公司销售的华法林（warfarin, Coumadin）^[3]以及赛诺菲安万特公司的氯吡格雷（clopidogrel, Plavix）是目前最畅销的两种抗血栓药物。华法林是一种口服抗凝剂，由DuPont公司（目前的百时美施贵宝公司）于20世纪40年代在美国上市。但是，华法林的使用剂量不当很可能引起过度抗凝及抗凝不足，分别表现为出血风险的提高及血栓形成风险的提高^[4]。Plavix能够预防曾发生过缺血性中风，血管栓塞，心梗发作或已有外周血管疾病的患者出现动脉粥样硬化。Plavix的缺点在于疗效不大。Lovenox（enoxaparin）也是由赛诺菲安万特推出，该药在全球抗栓药物中占据着很重要的地位。Pletaal（cilostazo）属于磷酸二酯酶抑制剂，具有抗血小板凝集及扩张血管作用，主要用于治疗间歇性跛行；该药也在巴西获批用于预防中风，在日本上市用于治疗复发性脑梗塞。专家认为，近年来临床在血栓治疗上取得的实质性进展很小，在这方面，备受关注的当属阿斯利康公司的血栓因子靶向抑制剂Exanta（ximelagatran）。Exanta已在许多欧盟国家上市用于大型整形术中静脉血栓形成的短期预防，但FDA因安全性及疗效问题对该药的推迟批准使得分析人士认为其上市后未必会一帆风顺。抗血栓药物市场的潜力是巨大的，谁填补了这个空白无疑将获得巨大的利润回报。

药物筛选是发现、开发药物过程中一个重要的环节，实验动物血栓模型的建立对评价与筛选抗血栓药物至关重要。目前建立血栓模型的方法主要有：（1）体外血栓形成法：该法由Chandler提出，系在体外旋转圆环内模拟体内的血流状态以形成血栓^[5]；（2）半体内血栓形成法：血流中的血小板接触旁路循环中的丝线粗糙面时，发生黏附、聚集，血小板聚集物环绕丝线表面形成血栓^[6]；（3）机械损伤法：机械损伤血管内膜后，使内皮细胞外基质裸露，促使血小板与胶原接触而被激活和黏附，启动凝血过程，导致血栓形成^[7]；（4）电流损伤法：利用电刺激，破坏局部血管，使血管内膜损伤，促使血小板黏附聚集从而形成血栓^[8]；（5）动脉异物法：动脉管腔狭窄形成湍流以及异物的诱导，均可激活血小板，使其黏附性和聚集性增加，血小板黏附于受损内膜下的胶原和异物，激活凝血途径形成血栓^[9]；（6）结扎法：该法常用于制备下腔静脉血栓模型，静脉结扎后，引起局部血流瘀滞、低氧，导致血管内皮损伤，启动凝血系统，从而导致静脉血栓形成^[10]；（7）光化学法：将光敏物质引入机体后在特定波长光线的照射下，发生光化学反应而产生单线态氧等活性氧，继而损伤血管内皮细胞，激发血小板聚集而形成血栓^[11]。