[发明专利]香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法

权利要求书

1.香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采集香蒲假茎，用超纯水洗净，并用滤纸吸去多余水分，放入液氮中速冻，并移至-80℃冰箱保存备用；

(2)称取5g步骤(1)保藏的香蒲假茎迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的细粉转入-20℃预冷的50ml离心管中，加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸/丙酮溶液，充分混合后，放在-20℃冰箱中静置2小时，备用；

(3)取步骤(2)得到的香蒲假茎细粉的三氯乙酸/丙酮溶液，在35000 转/分钟，4℃离心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000 转/分钟，4℃离心 30min，移去上清液，取沉淀，再加入25 ml -20℃预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，去掉上清液后，用滤纸将离心管封口，真空冷冻干燥，得到香蒲假茎蛋白粉；备用； 

(4)取步骤(3)得到的香蒲假茎蛋白粉在4℃溶于样品裂解液中1 小时，期间在裂解液中加玻璃珠，并用超声波超声三次，每次3分钟；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，得到上清液；然后用3倍体积预冷的样品洗涤液在-20℃沉淀1小时，然后再在35000转/分钟，4℃、离心30min，弃上清液，得离心沉淀后溶解于样品裂解液，在4℃溶解1小时，然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，取上清液，得到香蒲假茎蛋白质提取液，备用；

(5)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液，采用考马斯亮兰法测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；

(6)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液进行电泳分析:

第一向等电聚焦电泳：按上样量500μg，上样体积450μl, 用水化液对已定量好的香蒲假茎蛋白样品进行稀释；将香蒲假茎蛋白样品加入水化盘内后，再将线性IPG胶条胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用7ml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦；

(7)胶条平衡处理：将步骤(6)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，每次平衡时间为15min，二次平衡缓冲液的配制分别如下：

胶条平衡缓冲液母液组成：6mol/L的尿素，质量体积比2%的十二烷基磺酸钠，0.375mol/L的Tris-HCl，体积比30%甘油，溶剂为水；

第一次胶条平衡缓冲液                                                为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入20mg 二硫苏糖醇；

第二次胶条平衡缓冲液为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；

第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳：将平衡后的胶条置于胶浓度为12.5%的SDS-PAGE凝胶上，用浓度为0.5%低熔点琼脂糖的封胶液封住顶部，其中琼脂糖中含有质量体积比为0.002%的溴酚蓝，然后按如下参数进行电泳：16℃恒温，恒功率条件下，用2瓦/根胶条电泳1.5h，再用12瓦/根胶条电泳4~6h，直到溴酚蓝移动到需要的位置为止；

(8)电泳结束后对蛋白采用硝酸银法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测和分析。

2.根据权利要求1所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于，步骤(2)所述的三氯乙酸/丙酮溶液由下列物质组成：质量体积比10%的三氯乙酸，质量体积比0.07%的二硫苏糖醇，1mmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶剂为丙酮。

3.根据权利要求1所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于，步骤(3)所述的样品洗涤液由下列物质组成：质量体积比0.07% 的二硫苏糖醇和1mmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶剂为丙酮。

4.根据权利要求1所述的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，其特征在于，步骤(4)样品裂解液由下列物质组成：7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、质量体积比4%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、65mmol/L的二硫苏糖醇、1mmol/L苯甲基磺酰氟、体积比0.2%的载体两性电解质，溶剂为水。