[发明专利]香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物的质量分析和鉴定方法，具体涉及一种香蒲假茎中的总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，属于生物技术领域。

背景技术        

香蒲(Typha latifolia L.)，又名蒲菜、蒲草、水蜡烛，为香蒲科香蒲属多年生宿根性沼泽草本植物，分布于世界各地的沼泽及淡水湖泊中。在我国部分地区，其营养体幼嫩部分被用来作为蔬菜食用，风味独特，营养丰富，并且蒲菜还具有药用价值，其性味甘平，微凉，具有清凉补血，利水消肿之功效，因而是一种营养丰富并具一定药疗功能的保健型蔬菜。蒲菜中的主要营养物质和和药效物质为蛋白质类化合物，但植株体内还含有较多的次生代谢产物（如：色素、酚类、醌类等物质），现有技术中还没有针对蒲菜中蛋白成分的质量分析方法。因此为了对香蒲这一药食两用植物进行深入研究，并能方便鉴别其真伪，并对香蒲进行质量控制，为实现科学化种植和培育提供质控标准，很有必要在现有技术的基础上研究设计一种能对香蒲中的总蛋白质进行分离，建立适用于香蒲蛋白质组分有效分离、分析的方法，该方法可为香蒲水生植物材料蛋白质组学研究提供实验基础和参考。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明提供的香蒲假茎总蛋白质的提取和双向电泳分析方法，具体包括以下步骤：

(1)采集香蒲假茎，用超纯水洗净，并用滤纸吸去多余水分，放入液氮中速冻，并移至-80℃冰箱保存备用；

(2)称取5g步骤(1)保藏的香蒲假茎迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的细粉转入-20℃预冷的50ml离心管中，加入3倍体积-20℃预冷的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，充分混合后，放在-20℃冰箱中静置2小时，备用；

(3)取步骤(2)得到的香蒲假茎细粉的三氯乙酸（TCA）/丙酮溶液，在35000 转/分钟，4℃离心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000 转/分钟，4℃离心 30min，移去上清液，取沉淀，再加入25 ml -20℃预冷的样品洗涤液，充分混合后，放在-20℃保存1小时，期间间隔涡旋；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，去掉上清液后，用滤纸将离心管封口，真空冷冻干燥，得到香蒲假茎蛋白粉；备用；

(4)取步骤(3)得到的香蒲假茎蛋白粉在4℃溶于样品裂解液中1 小时，期间在裂解液中加玻璃珠，并用超声波超声三次，每次3分钟；然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，得到上清液；然后用3倍体积预冷的样品洗涤液在-20℃沉淀1小时，然后再在35000转/分钟，4℃、离心30min，弃上清液，得离心沉淀后溶解于样品裂解液，在4℃溶解1小时，然后在35000转/分钟，4℃离心 30min，取上清液，得到香蒲假茎蛋白质提取液，备用；

(5)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液，采用考马斯亮兰法（Bradford）测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；

(6)取步骤(4)得到的香蒲假茎蛋白质提取液进行电泳分析或对蛋白质进行质谱检测和分析。:

第一向等电聚焦电泳：按上样量500μg，上样体积450μl, 用水化液对已定量好的香蒲假茎蛋白样品进行稀释；将香蒲假茎蛋白样品加入水化盘内后，再将线性IPG胶条（优选pH 4-7，24cm，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用7ml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦；

(7)胶条平衡处理：将步骤(6)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，每次平衡时间为15min，二次平衡缓冲液配制如下：

胶条平衡缓冲液母液：6mol/L的尿素，质量体积比2%的十二烷基磺酸钠（SDS），0.375mol/L的Tris-HCl（优选pH为8.8），体积比30%甘油，溶剂为水；

第一次胶条平衡缓冲液                                                为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入20mg 二硫苏糖醇(DTT)；

第二次胶条平衡缓冲液为：每1ml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；