[发明专利]好氧硝化反硝化菌基因、其筛选方法及应用

权利要求书

1.一种好氧硝化反硝化菌基因，其特征在于，该基因为SEQ ID NO：1 所示的碱基序列。

2.一种筛选根据权利要求1所述的好氧硝化反硝化菌基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将用于水处理过程的生物活性炭，浸没在无菌水中，振荡24h，得到混合菌的菌液；

b.将步骤a中所得菌液接入富集培养基中连续培养三代；所述的富集培养基为：琥珀酸钠 9.63 g/l、NaNO₃  1.0 g/l、KH₂PO₄ 1.36 g/l、(NH₄)₂SO₄ 0.27 g/l、MgSO₄?7H₂O 0.19 g/l、酵母浸膏 1.0 g/l、微量元素溶液 1ml；

c.取步骤b所得的经富集的菌液，稀释10^-1—10^-7，随后涂布接种至BTB固体培养基，放入培养箱中30℃培养，挑取菌落周围培养基由绿色变为蓝色的菌株，在琼脂平板上划线纯化；所述的固体分离培养基为（g/l）：L-天冬酰胺 1.0、溴百里香酚蓝(1%乙醇溶液) 1ml、KNO₃ 1.0、KH₂PO₄ 1.0、FeCl₂?6H₂O 0.05、CaCl₂?2H₂O 0.2、MgSO₄?7H₂O 1.0，琼脂20.0，pH 7.0-7.3；

d.将步骤c所得经纯化的菌液经PCR扩增，得到好氧硝化反硝化菌基因的碱基序列。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于所述的PCR扩增过程的具体步骤为：

a.PCR体系建立（50ul）：

       Template   （基因组）     10pmol

       Primer up   (10μM)         1μl

       Primer down (10μM)        1μl

       dNTP mix (10Mm each)      1μl

       10*Taq reaction Buffer       5μl

       Taq (5μ/μl)                0.25μl

       加水至                   50μl

b.PCR 程序设定

       预变性98℃ 5min;

       循环 95℃ 35s , 55℃ 35s, 72℃ 1min 30s , 35个循环，

       延伸 8min

c.引物序列：

       Primer up     5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'  20bp

       Primer down   5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'   19bp。

4.一种根据权利要求1所述的好氧硝化反硝化菌株基因在含有氨氮和/或硝酸盐氮的水处理过程中应用。

5.根据权利要求4所述的好氧硝化反硝化菌株基因在含有氨氮和/或硝酸盐氮的水处理过程中应用，其特征在于该应用的具体方法为：挑取F3菌落，于扩大培养基中培养24小时，后调节OD₆₀₀至1，每200ml水样接种1ml菌液的比例接种至底物培养基，所述的限制底物培养基为(g/l)：琥珀酸钠 9.63、NH₄Cl 0.6、CH₃COONH₄ 0.5、MgSO₄?7H₂O 1.0、KH₂PO₄ 1.5、Na₂HPO₄ 0.42、NaNO₃ 1.0、微量元素溶液 2ml；调节琥珀酸钠的量，使得底物中C/N分别为6、4、2、1，培养温度分为30℃适温好氧培养、15℃低温好氧培养，120rpm/min，自然通气，pH值为7.0，培养时间为72h。