[发明专利]好氧硝化反硝化菌基因、其筛选方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种好氧硝化反硝化菌基因、其筛选方法及应用。

背景技术

氮是自然界中的一种主要组成元素，它在自然界里不断地进行迁移、转化和循环。在水体中氮元素以氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和有机氮的形式存在。自然界中的氮循环作用本来可以避免环境中某种形式氮的积累，但近年来各种人为因素破坏了这种自然平衡作用。随着经济社会的快速发展，河流、湖泊等水域的氮污染日益加剧。来源于工业、生活、农业和水产养殖的废水排放致使水体中的氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮大量增加。

以上这些氮元素大量排入水体会对环境及人体健康造成严重后果，主要表现为造成水体富营养化，破坏水体生态系统，增加给水处理成本；危及饮用水安全，如硝酸盐易导致婴幼儿变性血红蛋白症，亚硝酸盐对人体的三致威胁等。

目前水处理所用的脱氮工艺，如A/O法、A₂/O法、SBR法等，均要进行厌氧-好氧条件的转化，使得工艺的设计与控制相对复杂；在生物滤池等水处理工艺中，即使同时存在硝化和反硝化的现象，也是由于生物膜中氧气的传质不均导致部分膜内部缺氧所致。所以，如果能在真正的好氧条件下同时实现硝化和反硝化作用，同时达到去除水体中的氨氮和硝酸盐氮的效果，对于将来水处理工艺的简化和发展有重大意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种好氧硝化反硝化菌基因。

本发明的目的之二在于提供该基因的筛选方法。

本发明的目的之三在于提供该基因在水处理中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种好氧硝化反硝化菌基因，其特征在于，该基因为SEQ ID NO：1 所示的碱基序列。

一种筛选上述的好氧硝化反硝化菌基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将用于水处理过程的生物活性炭，浸没在无菌水中，振荡24h，得到混合菌的菌液；

b.将步骤a中所得菌液接入富集培养基中连续培养三代；所述的富集培养基为（g/l）：琥珀酸钠 9.63、NaNO₃  1.0、KH₂PO₄ 1.36、(NH₄)₂SO₄ 0.27、MgSO₄?7H₂O 0.19、酵母浸膏 1.0、微量元素溶液 1ml；

c.取步骤b所得的经富集的菌液，稀释10^-1—10^-7，随后涂布接种至BTB固体培养基，放入培养箱中30℃培养，挑取菌落周围培养基由绿色变为蓝色的菌株，在琼脂平板上划线纯化；所述的固体分离培养基为（g/l）：L-天冬酰胺 1.0、溴百里香酚蓝(1%乙醇溶液) 1ml、KNO₃ 1.0、KH₂PO₄ 1.0、FeCl₂?6H₂O 0.05、CaCl₂?2H₂O 0.2、MgSO₄?7H₂O 1.0，琼脂20.0，pH 7.0-7.3；

d.将步骤c所得经纯化的菌液经PCR扩增，得到好氧硝化反硝化菌基因的碱基序列。

上述的PCR扩增过程的具体步骤为：

a.PCR体系建立（50ul）：

Template   （基因组）     10pmol

Primer up   (10μM)         1μl

Primer down (10μM)        1μl

dNTP mix (10Mm each)      1μl

10*Taq reaction Buffer       5μl

Taq (5μ/μl)                0.25μl

加水至                   50μl

b.PCR 程序设定

预变性98℃ 5min;

循环 95℃ 35s , 55℃ 35s, 72℃ 1min 30s , 35个循环，

延伸 8min

c.引物序列：

Primer up     5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'  20bp

Primer down   5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'   19bp。