[发明专利]一种重组酶法生产右旋糖酐和果糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种联合诱导低成本制备重组右旋糖酐蔗糖酶的方法以及由此酶催化生产生物多糖和单糖的方法，特别涉及重组右旋糖酐蔗糖酶采用间隙振荡的酶催化方法，一步法催化合成右旋糖酐与果糖的方法。

背景技术

右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase,EC 2.4.1.5）是一种由肠膜状明串珠菌（Leuconstoc mesenteriodes）产生的葡萄糖基转移酶（Glucosyltransferases），由1250到1600个不同的氨基酸构成，分子量约为170KDa，其在多糖类药物合成、药用果糖、色谱分离介质和保健食品的制备等多个领域均具有重要应用。该酶的催化是以蔗糖为底物，将蔗糖分子中D-葡萄糖基催化转移形成D -glucosyl-Enzyme，并释放出果糖，其结果生成两类重要产品：①催化合成不同分子量右旋糖酐；②制备高纯的药用果糖。

右旋糖酐（dextran）是由若干葡萄糖脱水形成的聚合物，主要由α（1-6）苷键连接。因其具有安全、无毒、生物相容性好等多种优点，已被广泛应用于医药、食品等多个方面。临床应用有三种规格：右旋糖酐70、右旋糖酐40和右旋糖酐20，是一种优良的血容量补充药，同时也是生产补血药右旋糖酐铁的重要原料。分子量7万左右的右旋糖酐是目前公认的优良血浆代用品之一，有增加血容量作用，临床主要用于治疗失血性休克；分子量4万和2万左右的右旋糖酐具有改善微循环作用，主要通过解除红细胞聚集，减少血液粘度等作用而改善微循环，同时也具有一定的补充血容量作用。

果糖是一种左旋性的六碳糖，在人体内代谢比葡萄糖快，容易被机体吸收，且不依赖胰岛素，对血糖影响很小，适用于葡萄糖代谢及肝功能不全的患者补充能量，同时它还具有促进有益细菌繁殖，改善肠功能和代谢，不致龋齿等特性，因此果糖是糖尿病人、肥胖病人、儿童食品的理想甜味剂。运动前摄入果糖不会引起低血糖症，而通常如果在超长时间锻炼后摄入快速吸收的碳水化合物将引起此类低血糖症。欧、美、日和我国均已将果糖列入药典，作为口服或注射用，特别是葡萄糖代谢障碍者（糖尿病人）适用。

目前国内生产右旋糖酐工艺主要采用厌氧发酵、乙醇捏洗、盐酸水解、乙醇划分等。该工艺乙醇消耗量大，生产环境恶劣，发酵过程中菌体与葡聚糖互相缠绕而使菌体不能除去，生产中又引入了杂氮、氯离子、硫酸盐灰分等杂质，致使其产品质量指标达不到日本、欧美的药典标准，无法进入国际市场，缺少竞争力；而且杂质含量高的药用右旋糖酐导致临床过敏性副反应多。国内对右旋糖酐生产工艺研究仅限于在传统发酵工艺中对发酵液过滤，水解、分级划分等单元操作的改进，不能从工艺本质上提高产品质量。

本发明人于2005年从肠膜状明串珠菌中克隆获得了此酶的完整基因dexYG（GenBank No. DQ345760）。然后以此基因为基础构建了能高效表达的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌，该基因工程菌已经获得了专利（ZL 200710134765.4）。本发明从拥有自主知识产权的基因工程菌BL21 (DE3)/pET28-dexYG 入手，获得成本较低的IPTG与乳糖联合诱导制备重组右旋糖酐蔗糖酶的方法，并利用重组右旋糖酐蔗糖酶采用间隙振荡的酶催化方法，一步法生产右旋糖酐和果糖，大幅提高了转化效率。实现一酶多用、回收果糖，降低了成本，提高产品质量，并解决了右旋糖酐原生产工艺中付产物果糖对环境的污染问题。

发明内容

本发明的目的在于运用成本较低的IPTG与乳糖联合诱导法制备游离重组右旋糖酐蔗糖酶，然后以此重组酶基础，由底物蔗糖开始采用间隙振荡的酶催化方法一步制备右旋糖酐和果糖，此生产方法取代由肠模状明串珠菌生产右旋糖酐的工艺，避免随着细菌的生产过程中出现的菌体, 消除杂蛋白，提高产品质量；实现一酶多用、回收果糖，降低了成本，并解决了右旋糖酐原生产工艺中付产物果糖对环境的污染问题。

本发明的重组酶法生产右旋糖酐和果糖的方法，包括下述步骤：