[发明专利]一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法

权利要求书

1.一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将无菌的黄芩外植体接种于预培养基上，25～28℃黑暗条件下预培养2～3d；

所述的预培养基为含有0.15～1.0mg/kg 6-BA和0.1～0.35mg/kg NAA的MS固体培养基；

2)在预培养的黄芩外植体上划痕，加入活化的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌液，并添加乙酰丁香酮，使其终浓度为200～600μg/mL，感染10～30min；将黄芩外植体转移到MS固体培养基上，25～28℃黑暗培养2～3d，再转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25～28℃黑暗培养，诱发毛状根；

3)待经发根农杆菌感染的黄芩外植体上长出的毛状根达到2～3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25～28℃黑暗培养，直至发根农杆菌生长被抑制，然后切取毛状根；

4)将切取的毛状根接种于MS固体培养基上，25～28℃避光培养，每30天继代培养一次；

5)选取MS固体培养基继代培养2次以上、生长旺盛的毛状根，接种到MS液体培养基上，100～200r/min振荡、25～28℃避光培养，筛选生长迅速、能稳定产生黄芩苷的黄芩毛状根株系；

6)选取MS液体培养基中生长旺盛的黄芩毛状根株系，切取根尖部分，接种到优化培养基上，100～200r/min振荡、25～28℃避光培养，培养到32～38d补加培养液，培养至60～80天收获毛状根；

所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加10～60g/L的碳源、0.3～1.0g/L的氮源、20～100mg/L的生物诱导子、5.3×10^-5～3.0mmol/L的非生物诱导子和0.2～0.6mg/L的外源激素，pH值为4.0～7.0；

所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca²⁺、Mg²⁺或Co²⁺；外源激素为NAA或6-BA。

2.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的毛状根液体基本培养基为MS培养基或采用以下配方：包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5.8～6.0；

所述的大量元素为KNO₃：950mg/L、KH₂PO₄：42.5mg/L、MgSO₄·7H₂O：185mg/L和CaCl₂·2H₂O 220mg/L；

微量元素为KI：0.83mg/L、H₃BO₃：6.2mg/L、MnSO₄·4H₂O：22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O：8.6mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O：0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O：0.025mg/L和CoCl₂：0.025mg/L；

铁盐为Na₂·EDTA：18.65mg/L和FeSO₄·7H₂O13.9mg/L；

有机成分为肌醇：100mg/L、甘氨酸：2mg/L、盐酸硫胺素：0.1mg/L、盐酸吡哆醇：0.5mg/L和烟酸：0.5mg/L。

3.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的切取的根尖部分是按照5～8g/L的接种量接种到优化培养基中。

4.如权利要求1所述的基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，其特征在于，所述的黄芩外植体的获得为：

将无菌的黄芩种子萌发后接种于含有0.15～1.0mg/kg 6-BA和0.1～0.35mg/kg NAA的MS琼脂培养基上，在25～28℃培养，生长成苗，切取苗的茎段作为外植体。