[发明专利]一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法

说明书

技术领域

本发明属于黄芩的人工培育技术领域，涉及一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法。

背景技术

黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi.)为唇形科(Labiatae)植物，是一种常用的中药。其性寒、味苦，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有抗菌消炎、清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。黄芩为多年生草本植物，喜温和气候，耐寒冷、干旱，主要分布于河北、辽宁、陕西、山东、内蒙古等地，主要成分是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等。随着国际上对黄芩研究的深入，黄芩的主要成分黄芩苷在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫以及抗肿瘤和HIV等多方面均有较好作用。随着新药不断开发，黄芩苷用量迅速增加，近年来，药材产地环境污染和农药喷施，都给黄芩资源的可持续发展带来严重危机。

自1997年Ackermann首先用发根农杆菌转化高等植物以来，迄今已有100多种植物建立了培养系统。利用发根农杆菌诱导植物产生毛状根，并对毛状根进行离体培养，生产有用的次生代谢产物，是使该植物可持续发展的有效途径之一。毛状根生长迅速，分支多无向地性，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，次生代谢产物含量高，处于器官化水平，基本上保持了正常根的生化功能，且比细胞培养容易放大，该方法特别适合根用植物。因此通过大量培养毛状根替代野生资源，对保护环境与中药的可持续发展具有重大意义。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于发根农杆菌感染的诱发黄芩毛状根的培育方法，能够快速、高诱发率的诱发毛状根，解决黄芩资源短缺的问题。

本发明是通过以下技术方案来实现：

1)将无菌的黄芩外植体接种于预培养基上，25～28℃黑暗条件下预培养2～3d；

所述的预培养基为含有0.15～1.0mg/kg 6-BA和0.1～0.35mg/kg NAA的MS固体培养基；

2)在预培养的黄芩外植体上划痕，加入活化的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌液，并添加乙酰丁香酮，使其终浓度为200～600μg/mL，感染10～30min；吸弃剩余的菌液后，将黄芩外植体转移到MS固体培养基上，25～28℃黑暗培养2～3d，再转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25～28℃黑暗培养，诱发毛状根；

3)待经发根农杆菌感染的黄芩外植体上长出的毛状根达到2～3cm时，在无菌条件下切下毛状根，将其转移到含抗菌素的MS固体培养基上，25～28℃黑暗培养，直至发根农杆菌生长被抑制，然后切取毛状根；

4)将切取的毛状根接种于MS固体培养基上，25～28℃避光培养，每30天继代培养一次；

5)选取MS固体培养基继代培养2次以上、生长旺盛的毛状根，切取根尖部分，接种到MS液体培养基上，100～200r/min振荡、25～28℃避光培养，筛选生长迅速、能稳定产生黄芩苷的黄芩毛状根株系；

6)选取MS液体培养基中生长旺盛的黄芩毛状根株系，切取根尖部分，接种到优化培养基上，100～200r/min振荡、25～28℃避光培养，培养到32～38d补加培养液，培养至60～80天收获毛状根；

所述的优化培养基是在毛状根液体基本培养基上添加10～60g/L的碳源、0.3～1.0g/L的氮源、20～100mg/L的生物诱导子、5.3×10^-5～3.0mmol/L的非生物诱导子和0.2～0.6mg/L的外源激素，pH值为4.0～7.0；

所述的碳源为葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源为硝酸铵或水解乳蛋白；生物诱导子为黑曲霉、米曲霉或蜜环菌诱导子；非生物诱导子为Ca²+、Mg²⁺或Co²⁺；外源激素为NAA或6-BA。

所述的毛状根液体基本培养基为MS培养基或采用以下配方：包含大量元素、微量元素、铁盐和有机成分，pH为5.8～6.0；

所述的大量元素为KNO₃：950mg/L、KH₂PO₄：42.5mg/L、MgSO₄·7H₂O：185mg/L和CaCl₂·2H₂O 220mg/L；