[发明专利]一种电穿孔转染昆虫细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种电穿孔转染昆虫细胞的方法。

背景技术

随着生物技术的发展，越来越多的外源重组质粒需要转染或转化到宿主细胞（细菌、酵母或动物细胞）中用于表达外源基因或研究某些基因的功能。大肠杆菌的转化常用化学转化法和电穿孔转化法，酵母细胞的转化采用电穿孔转化法和原生质体转化法，而动物细胞可用脂质体转染法和电穿孔转染法。现有的动物细胞尤其是哺乳动物细胞普遍采用脂质体转染法，电穿孔转染法使用比较少，而昆虫细胞一般采用脂质体转染法，没有关于电穿孔转染法的报道。

昆虫细胞在基因工程表达外源基因方面日益受到人们的重视，昆虫细胞与杆状病毒组合形成了一个强大而通用的表达系统，具有大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工外源蛋白的能力。杆状病毒表达系统安全性高，对外源基因克隆容量大，重组病毒易于筛选，具有多角体启动子控制下，能够稳定而高效表达，容易从无血清培养上清中纯化，无内毒素污染等特点。昆虫细胞－杆状病毒表达系统作为表达系统之一，已广泛应用于基础研究、医药卫生和农业技术创新等各个领域。但是，Invitrogen公司的Bac-to-Bac、Clonetech公司的pBacPak、BD公司的BaculoGold以及其他公司的杆状病毒表达系统，将外源基因重组到穿梭质粒上后，与线性化野生型病毒基因组共同转染昆虫细胞或者直接将重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞时，都采用脂质体如Cellfectin来完成，这种试剂虽然每次用量较少，但一个包装都比较昂贵，未使用完放置时间较长也会过期或失效。而一般基因工程实验室都有电穿孔仪器用于细菌或酵母的转化，而用于动物细胞尤其是昆虫细胞的电穿孔转染外源基因极为少见，理论上是可以转染质粒，但是没有详细的操作方法和说明。采用电穿孔方法转染昆虫细胞不仅可以充分利用现有的实验室仪器，而且避免了重复购置转染试剂以及试剂过期失效造成的浪费。在转染质粒的操作上，脂质体转染动物细胞的周期较长，一般超过5小时以上；而电穿孔转染仅需5分钟，周期短。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用电穿孔技术将质粒或基因组转化到昆虫细胞的方法。本发明中昆虫细胞表达系统来包括来自于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的 Sf-9、Sf-21昆虫细胞系以及商品化的High Five^TM昆虫细胞系；杆状病毒来自于苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica NPV，AcNPV)，并由此构建的杆状病毒基因组（Bacmid）转化形成E. coli DH10BAC，以及穿梭质粒pFastBac，用于将外源基因通过同源重组整合到Bacmid中，从而形成重组的杆状病毒基因组。将病毒基因组转染昆虫细胞后形成具有感染性的重组杆状病毒。

所述方法按如下步骤进行：

1）构建含报告基因的重组杆状病毒基因组

报告基因经过酶切重组到穿梭质粒中形成含报告基因的重组穿梭质粒后，将含报告基因的重组穿梭质粒在大肠杆菌中通过同源重组构建含报告基因的重组杆状病毒基因组。

2）电穿孔转染昆虫细胞

将重组杆状病毒基因组和昆虫细胞在电穿孔缓冲液中混和，在电穿孔仪器中按照电穿孔条件进行电穿孔转染，从而将外源基因转染到昆虫细胞中，所述的电穿孔缓冲液为200-400mM蔗糖，7-13mM Na₃PO₄，1-3mM MgCl₂，pH6.2-6.6；电穿孔条件为电压 100-140V，电击时间25-35ms，温度0-25℃。

本发明所述的方法中穿梭质粒为pFastBac1、pFastBac^TM Dual、pBacPak、pAcSG及其衍生质粒。

本发明所述的方法中昆虫细胞为Sf-9细胞、Sf-21细胞、High Five细胞 。

与常规转染昆虫细胞普遍采用的脂质体转染方法相比，本发明采用电穿孔方法将外源质粒转染昆虫细胞比较简便、周期短、成本低，不必购买昂贵的转染试剂，而且转染效果和效率与脂质体转染法相近。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明实施方案。

图1是GFP基因扩增电泳图。泳道1为 DNA Marker；泳道2为 GFP基因片段。

图2是重组穿梭质粒GFP/pFastBac的双酶切鉴定电泳图。泳道1为DNA Marker；泳道2和3为重组穿梭质粒基因片段的BamHⅠ与xhoⅠ双酶切产物。