[发明专利]复合微生物饲料添加剂的制备方法及其应用

权利要求书

1.一株丁酸梭菌菌株，其分类命名为：丁酸梭菌（Clostridium butyricum）RH-2，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.4664。

2.一种复合微生物饲料添加剂，其特征在于所述复合微生物饲料添加剂由丁酸梭菌活菌制剂和地衣芽孢杆菌活菌制剂组成；其中丁酸梭菌活菌制剂由保藏编号为CGMCC No.4664的丁酸梭菌RH-2经过三角瓶种子培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥、与碳酸钙混合后低温干燥、粉碎过筛，最后再与辅料淀粉混合得到；地衣芽孢杆菌活菌制剂由地衣芽孢杆菌经过斜面菌种培养、茄子瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养、离心收集菌泥、与碳酸钙混合、低温干燥、粉碎过筛，最后再与辅料淀粉混合得到；将丁酸梭菌活菌制剂和地衣芽孢杆菌活菌制剂按质量1︰1比例均匀混合即得复合微生物饲料添加剂，所述复合微生物饲料添加剂含丁酸梭菌0.25亿~2.5亿cfu/g、含地衣芽孢杆菌5亿~10亿cfu/g。

3.权利要求1所述复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于制备步骤如下：

（1）丁酸梭菌活菌制剂的制备

a、三角瓶种子培养：配制液体培养基，调节pH 6.5~7.5，分装三角瓶中， 150mL三角瓶装100mL，2000mL三角瓶装1800~1900mL，121℃灭菌20~30分钟，冷却后将丁酸梭菌CGMCC No.4664冷冻管接种至150mL三角瓶中，于厌氧条件下30~38℃培养14~24小时；将长好的丁酸梭菌种子以5%~10%的接种量转接入2000mL三角瓶中，于30~38℃静止培养14~24小时；

b、种子罐培养：在50L种子罐中加入液体培养基，装液量70%，调节pH至7.0~8.5，开搅拌，121℃灭菌20~30分钟，开冷却水降温，并通无菌氮气控制罐压0.04MPa~0.06MPa，当温度降至36~38℃时，将长好的大三角瓶种子液以5%~10%的接种量转入种子罐的培养基中，保持30~38℃、罐压0.04MPa~0.06MPa静止培养14~24小时；

c、发酵罐培养：当种子罐培养液的pH降至4.5~5.0、菌数达到5~15亿cfu/mL时，将种子罐中的培养液以5%~10%的接种量转入装有350L液体培养基的500L发酵罐中，保持30~38℃、罐压0.04MPa~0.06MPa，静止培养14~24小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同；

d、配制丁酸梭菌活菌制剂：当发酵罐培养液中的丁酸梭菌芽孢率达90%~95%时，将培养液通入管式高速离心机中收集菌泥，将收集到的湿菌泥与无水碳酸钙以1︰4~6的质量比例充分混匀，于40~60℃干燥，粉碎过80目筛，然后再将所得菌粉与玉米淀粉以1︰4的质量比例混匀，制成丁酸梭菌活菌制剂；或直接将湿菌泥与无水碳酸钙以1︰4~6的质量比例充分混匀后直接与淀粉以1︰4的质量比例混匀，再经干燥粉碎后制成丁酸梭菌活菌制剂；

所述液体培养基配方：蛋白胨8~20g，酵母膏 5~15g、磷酸氢二钾0.2~2g，磷酸二氢钾0.2~2g，硫酸镁0.1~2g，葡萄糖 8~20g，碳酸钙1~10g，水1000mL；

（2）地衣芽孢杆菌活菌制剂的制备

a、菌种培养：将保存的地衣芽孢杆菌转接在新鲜配制的固体培养基摆成的试管斜面上，于30~37℃培养24小时，取此斜面菌种转接2个250mL的茄子瓶斜面，于30~37℃培养24小时；

b、种子罐培养：在100L种子罐中加入液体培养基，装液量70%，调节pH至7.6~7.8，开搅拌，121℃灭菌20~30分钟，开冷却水降温，并通无菌空气控制罐压0.04MPa~0.06MPa，当温度降至36~38℃时，将长好的2个茄子瓶上菌泥用100~200mL无菌生理盐水清洗，接种至种子罐内的液体培养基中，保持30~38℃、罐压0.04MPa~0.06MPa，搅拌速度为120~160转/分，进行深层通气搅拌培养16~24小时；

c、发酵罐培养：当种子罐内培养液中地衣芽孢杆菌的菌数达到20~30亿cfu/mL时，将种子罐中的培养液以5%~10%的接种量转入1m³发酵罐中的液体培养基中，保持30~38℃、罐压0.04MPa~0.06MPa，搅拌速度为120~160转/分，进行深层通气搅拌培养24~30小时；发酵罐培养基组成和配制方法与种子罐相同；

d、配制地衣芽孢杆菌活菌制剂：发酵罐培养液中地衣芽孢杆菌芽孢率达90%~95%时，将发酵罐中的培养液通入管式高速离心机中收集湿菌泥，将收集到的湿菌泥与无水碳酸钙以1︰4~6的重量比例充分混匀，于40~60℃干燥后粉碎过80目筛，然后再将菌粉与玉米淀粉以1︰3的重量比例混匀，制成地衣芽孢杆菌活菌制剂；

或将湿菌泥与无水碳酸钙以1︰4~6的重量比例充分混匀后直接与玉米淀粉以1︰3的重量比例混匀，再经干燥粉碎后制成含地衣芽孢杆菌活菌制剂；

所述固体培养基的配制：按蛋白胨8~10g，牛肉膏5~7g，氯化钠5~7g，蒸馏水定容1000mL，调节pH 7.2~7.4，加入18~20g琼脂后加热熔化，装18×180mm的试管，每支8mL；装250mL的茄子瓶，每个装85mL；121℃灭菌30分钟，冷却至50℃摆成斜面备用；

所述液体培养基的配方：蛋白胨5~15g，葡萄糖0.5~5g，玉米粉4~6g，豆粕粉4~10g，酵母膏4~6g，磷酸二氢钾0.5~1.5g，硫酸镁0.3~1g，硫酸锰5~20mg，水1000mL；

（3）复合微生物饲料添加剂的配制：将步骤（1）制得的丁酸梭菌活菌制剂与步骤（2）制得的地衣芽孢杆菌活菌制剂以1︰1的质量比例均匀混合即制成产品复合微生物饲料添加剂。