[发明专利]一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法

权利要求书

1.一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法，其特征在于通过搅拌筛选获得处于同一细胞周期的绵羊卵母细胞，将供体胞细胞核通过显微注射到所述绵羊卵母细胞后立即用融合液处理，融合后的胚放入成熟液培养形成融合胚胎。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述绵羊卵母细胞的制备方法为：预温的生理盐水清洗新鲜卵巢，收集卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡与吸卵液中，卵泡液凝集为絮状后，用细棒轻柔搅拌使凝集物聚集，将凝集团撕碎并继续搅拌；在体视显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合体，成熟液中洗3遍，置于成熟培养液微滴中，38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养。

3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述供体细胞为成纤维细胞，来源于40天胚龄胎儿的头部。

4.权利要求2所述的方法，其特征在于所述吸卵液组成为：100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素，0.5%FBS，25mg/ml肝素TCM199。

5.权利要求2所述的方法，其特征在于所述成熟液体组成为:15%PG处理后发情绵羊血清10 μg/ml FSH，20 μg/ml LH，1.5 μg/ml 17-?E2溶于TCM199。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于所述供体细胞的制备方法为：剖腹取40天胚龄的绵羊胎儿头部皮肤，尽量撕碎，将组织块按5mm左右间隔，接种在50 ml卡氏培养瓶的瓶底，每个瓶接种约25块左右，要尽量将组织块的切面贴在瓶底上，使组织块粘附在瓶底，放入培养箱，静置3h-4h，加5ml含15%FBS的DMEM/F12培养液，放入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内静置培养3d后，换5ml含15%FBS的DMEM/F12新鲜培养液；以后每3d换培养液一次，3d-4d可明显看到组织块周围有细胞长出，细胞向周围扩展，5d-8d由组织块长出的细胞汇合，可消化传代，筛选长势旺盛的成纤维细胞，选取5代以内的自然生长汇合的成纤维细胞作为核供体，用0.05%TE 37℃消化1min，离心收集细胞后用操作液清洗3次放4℃冰箱备用。

7.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述显微注射的具体步骤为：显微镜下筛选排出第一极体绵羊卵母细胞，置于覆盖有石蜡油10μl含10%FBS的H-M199的微滴中，通过显微注射将权利要求4所述供体细胞移植入去核绵羊卵母细胞透明带下，轻轻触压使供体细胞与细胞膜紧密接触，注射完成后立刻使用融合液处理。

8.一种可提高胚胎融合效率的融合液，其特征在于组成为：0.05-0.15g/LBSA，0.20-0.35M甘露醇，0.05-0.20mM醋酸钙，0.5-2 mM Hepes，超纯水溶解，不调pH值，调节渗透压为253-268 mOsm,0.22μm滤膜过滤，分装后4℃储存。

9.权利要求8所述的融合液，其特征在于组成为：0.08-0.12g/LBSA，0.05-0.30M甘露醇，0.08-0.12mM醋酸钙，0.8-1.2 mM Hepes，超纯水溶解，不调pH值，调节渗透压为253-268 mOsm,0.22μm滤膜过滤，分装后4℃储存。

10.权利要求9所述的融合液，其特征在于组成为：0.1g/LBSA，0.28M甘露醇，0.1mM醋酸钙，1 mM Hepes，超纯水溶解，不调pH值，调节渗透压为253-268 mOsm,0.22μm滤膜过滤，分装后4℃储存。