[发明专利]一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法，属于胚胎移植的方法领域。

背景技术

目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微注射和细胞融合方法移植到卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。

目前细胞核移植过程中，操作人员大都仅凭主观判断来挑选用作成熟的卵母细胞，所有关于猪，山羊，绵羊、牛（Keefer， CL, H., Baldassarre, R.,Keyston. 2001. Generation of dwarf goat (Capra hircus) clones following nuclear transfer with transfected and nontransfected fetal fibroblasts and in vitro-matured oocytes. Biology of Reproduction, vol. 64 no. 3 849-856; 翁凡,郑小亮,刘哲.哺乳动物卵母细胞去核方法的研究进展[J],安徽农学通报.2007年21期; 桑国俊，牛卵母细胞及体外胚培养技术研究[D].甘肃农业大学.2008年; 吴志南，山羊卵泡卵体外成熟、体外受精及冷冻保存方法的研究[D].扬州大学.2005年）的卵母细胞筛选的报道和论文都是采取在体视显微镜下挑选有2-3层颗粒细胞的卵丘-卵母细胞复合体的方法，并不进行初步的筛选。且胚胎融合率较低，导致大量胚胎浪费及高昂成本，因此急需开发一套高效制备绵羊克隆胚胎的方法，包括优质核供体细胞的制备方法、通过搅拌法初步筛选绵羊卵母细胞以提高绵羊卵母细胞的成熟效率，提高核移植操作的效率，提高融合效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效制备绵羊克隆胚胎的方法，以提高绵羊克隆胚胎制作效率。

为解决上述技术问题，本发明通过搅拌筛选提高绵羊卵母细胞的体外成熟效率；选取长势良好的生长汇合的成纤维细胞作为核供体；采取挤压去核同时注核的方法提高核移植效率；通过优化融合液配方提高胚胎融合效率。

具体实施步骤为：

成熟绵羊卵母细胞的制备：将采集的卵巢置于30℃-35℃的灭菌生理盐水中，1h-2h内运回实验室。用预温的生理盐水清洗卵巢，用带8#针头的10ml注射器，内有吸卵液(含青霉素(100IU/ml)、链霉素(100IU/ml)，0.5%FBS，25mg/ml肝素TCM199（Tissue Culture Medium 199）)，吸取卵巢表面2mm-6mm大小的卵泡，卵泡液收集于烧杯中，静置5min后卵泡液凝集为絮状，用细棒轻柔搅拌凝集物，待凝集物聚集成团后将凝集团扯碎并继续搅拌。将搅拌后卵泡液放在体视显微镜下收集有两层以上卵丘细胞包裹的绵羊卵母细胞用于成熟，将收集的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus Oocyte Complexes，COCs) 在成熟液中洗3遍，置于100μl成熟培养液微滴中，每滴放15个COCs，置于38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中成熟培养。

供体细胞的准备：剖腹取40天胚龄的绵羊胎儿头部皮肤，尽量撕碎，将组织块按5mm左右间隔，接种在50 ml卡氏培养瓶的瓶底，每个瓶接种约25块左右，要尽量将组织块的切面贴在瓶底上，使组织块粘附在瓶底，放入培养箱，静置3h-4h，加5ml含15%FBS（fetal calf serum）的DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium mixed 1:1 with Ham's F-12)培养液，放入37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱内静置培养3d后，换5ml含15%FBS的DMEM/F12新鲜培养液。以后每3d换培养液一次，3-4d可明显看到组织块周围有细胞长出，细胞向周围扩展，5d-8d由组织块长出的细胞汇合，用0.05%TE（胰蛋白酶－EDTA）消化传代，筛选长势旺盛的成纤维细胞，取5代以内的自然生长汇合的成纤维细胞作为核供体，用0.05%TE 37℃消化1min，离心收集细胞后用操作液清洗3次放4℃冰箱备用。

克隆胚胎的制备：