[发明专利]一种酶联检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人血管内皮细胞生长因子（VEGF）的酶联检测试剂盒。

本发明还涉及上述试剂盒的制备方法。

背景技术

肿瘤的发展和转移是多阶段的、复杂的、具有高度选择性的过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的关系，其机理尚不甚清楚。近年来关于新的血管生成与肿瘤发展、转移和预后关系的研究进展迅速，证明新的血管生成是肿瘤生成、转移和转移灶生长的必要条件，血管内皮细胞生长因子（VEGF）是调节新血管生成的最重要的细胞因子。研究表明血管内皮细胞生长因子（VEGF）在血管系统的发育分化中具有不可替代的作用（Ferrara et al. Endocr. Rev.1997,18:4-25）。

VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，有两个相同亚单位通过二硫键结合形成，等电点为8.5，有很强的耐热和耐酸能力。人VEGF基因有5种不同的异构体，分别为VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。

VEGF高亲和力结合位点仅位于血管内皮细胞上的3种VEGF受体，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，这3种受体主要分布于血管内皮细胞表面，均是跨膜受体。研究表明，VEGF受体在体外与VEGF有高度的亲和力（Kendall et al. PNAS USA, 1993, 90: 10705-9）。

VEGF是癌症生长、转移所必需的一种因子。目前研究表明，在人类各种恶性肿瘤（即癌症）疾病中，VEGF的分泌增加有着普遍性和广泛性。有大量文献报道，VEGF在正常人和癌症患者中的浓度明显不同，正常人中的VEGF浓度很低或检测不到，而在癌症患者中VEGF浓度很高。因此，检测人血液中的VEGF浓度，能够用于癌症的早期普查诊断。另一方面，VEGF在人体血液中的浓度随肿瘤的消长情况而变化。肿块大、生长快时，VEGF的血液浓度就高；而当肿瘤因化疗或手术“临床治愈”时，VEGF的血液浓度降低。故VEGF得检测可作为疗效观察和预后的指标。VEGF是恶性肿瘤诊断中的一个重要组成部分。另外，血液VEGF水平增高亦见于糖尿病、血管炎症性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。

Yeo et al.(Clin. Chem. 1992, 38:71)报道了以免疫荧光为基础的检测VEGF的ELISA方法，但其检测灵敏度较低。Houck et al.(J Biol. Chem. 1992, 267:26031)报道了以比色发为基础的检测VEGF的ELISA方法，但其检测敏感度仅为 ng/ml。 Hanatani et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995, 59:1985)报道了测定VEGF的化学发光ELISA，测定正常人的血清VEGF水平为8-36 ng/l。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶联免疫检测人血管内皮细胞生长因子（VEGF）的检测试剂盒。该试剂盒结果准确稳定、特异性强、灵敏度高、使用方便、便于推广。

本发明的另一目的是提供上述酶联检测试剂盒的生产制备及使用方法。

为实现上述目的，本发明提供的试剂盒组成为：

1. 酶联板；2. 阳性对照（冻干）；3. 阴性对照（冻干）；4. 样品稀释液；5. 酶联物；6. 浓缩洗涤液；7. 显色剂A＆B；8. 终止液；9. 封板胶纸。

本发明提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下：

（a）以酶联反应板为固体支持物，将VEGF单克隆抗体包被于固体支持物上；

（b）用封闭液封闭；

（c）将生物标本与固定于酶联板上的VEGF单克隆抗体接触和保温，生物标本中的VEGF特异地与VEGF单克隆抗体结合；

（d）从VEGF单克隆抗体上分离生物标本；

（e）用辣根过氧化物酶（HRP）标记的VEGF多克隆抗体检测VEGF，所用显色底物为3，3＇,5 ,5＇-四甲基联苯胺（TMB）。

本发明试剂盒的独特性在于，它使用VEGF单克隆抗体包被酶联板，能够确保VEGF能被本试剂盒所检测，能对标本有准确的测定。

本试剂盒检测生物标本中的VEGF，优选来自癌症、血管病病人或其他疾病病人的标本。

附图说明

图：本发明试剂盒盒体及组成成份。

具体实施方式

下述实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。

实施例1：

本发明的试剂盒举例可以是下列物质：