[发明专利]一种检测磷脂依赖性凝血因子X激活物酶活性的方法

权利要求书

1.一种检测磷脂依赖性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)配制pH＝7.4，浓度为0.02M的Tris-HCl缓冲液；

(2)配制浓度为0.075M的CaCl₂溶液；

(3)用10ml(1)步制备的缓冲液将10mg人血清白蛋白配制成浓度为1mg/ml血清白蛋白稀释液；

(4)FXA生色底物S-2765与(1)步制备的缓冲液和(2)步制备的CaCl₂溶液混合，配制成溶液A；

(5)用(1)步制备的缓冲液将Human Factor X稀释成溶液B；

(6)用(1)步制备的缓冲液和(3)步制备的血清白蛋白稀释液将已知浓度的FXA单体标准品稀释成一系列不同浓度的母液C_n(n≥1)；

(7)用(1)步制备的缓冲液和(3)步制备的血清白蛋白稀释液将待测样品稀释成溶液D_n(n≥1)；

(8)将相同体积的一系列不同浓度标准品母液C₁、C₂、C₃......C_n(n≥1)与待测样品溶液D_n分别加到酶标板不同孔中，再向每孔中补充相同体积的溶液A和相同体积的溶液B，保持每孔溶液的总体积一致，把孔内溶液混匀，立即放入预热至37℃的酶标仪中反应，分别测定每孔中酶解产物对硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，并根据测定得到的不同浓度标准品母液吸光度A405值，绘制FXA单体标准品的浓度-吸光度线性标准曲线；

(9)将测定得到的待测样品D_n的吸光度A405值，代入(8)步得到的PNA标准曲线，确定待测样品的酶浓度和活性。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(5)步中溶液B的浓度为2.5μM。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(4)步中溶液A的制备过程为用(1)步制备的缓冲液将FXA生色底物S-2765配制成3mM的浓度后，精密量取0.8ml已制备3mM S-2765溶液并加入0.6ml(2)步制备的CaCl₂溶液，混匀。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(6)步中母液C的浓度分别为1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2Ku/ml。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(8)步中酶标板每孔加入标准品母液C和待测样品溶液D体积均为7μl，溶液A体积为23μl、溶液B体积为30μl，每孔溶液总体积为60μl。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶标板中每孔溶液总反应体积为60μl时，加入FXA单体标准品母液C活性单位＜2Ku/孔，溶液A浓度≥0.039mM。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述(8)步中酶标仪预热时间为4分钟，反应时间为15分钟。