[发明专利]一种检测磷脂依赖性凝血因子X激活物酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及药品、生物制品领域，具体涉及一种生色底物法测定磷脂依赖性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法。

背景技术

蛇毒血凝酶是从蝰蛇毒中提取并利用现代生物技术分离纯化精制而成。它是一种以止血作用为主的酶制剂，含有两种可促进血液凝固的成分，分别为蝰蛇巴曲酶(Batroxobin)和磷脂依赖性凝血因子X激活物(简称FXA)。其中FXA是一种高度特异性的、具有蛋白水解酶特性的酶类，在响尾蛇和蝰蛇的蛇毒中分布广泛。绝大多数蛇毒FXA是从圆斑蝰蛇和Macrovipera lebetina中纯化得到的，分别称作为RVV-X和VLFXA，其中RVV-X的活力最强。这两种FXA均由一条重链α及两条由二硫键相连的C型凝集素结构的轻链β、γ组成，α重链和γ轻链的初级结构在两者中相似，重链均含有金属酶、去整合素和半胱氨酸富集结构域。

1994年Gowda等人用质谱测定得到RVV-X的分子量为92,880Da，SDS-PAGE显示重链为57,600Da，轻链分别为19,400和16,400Da，等电点pI为4.2～7.8。其在中性条件下(pH＝6.5-8.0)稳定，在酸性(PH＝3～6)和碱性(PH＝9～11)条件下活性迅速下降。RVV-X的含糖量为10％，脱糖基化可显著地影响其活力，催化速率下降约130倍。

早在1934年，Macfarlane和Barnett就发现FXA能够加速血液凝固，并需要Ca²⁺参与才能够达到最大活力，而且受金属螯合剂的抑制。1962年，Williams和Esnouf用DEAE纤维素柱分离纯化得到了促凝血物。FXA是一种能够作用于凝血因子X和凝血因子IX的金属酶，能够切断浓集于磷脂反应表面的凝血因子X重链上的Arg51-Ile52肽键，将其激活成为Xa。后者可参与外源性凝血和内源性凝血过程，与Ca²+、凝血因子Va及血小板磷脂(PF3)形成复合物(凝血酶原激活物)，将凝血酶原转变为凝血酶，纤维蛋白原又被凝血酶酶解为纤维蛋白单体，其可促使凝血酶对因子ⅩⅢ的激活，在ⅩⅢ与钙离子的参与下，相邻的纤维蛋白发生快速共价交联，形成不溶的稳定的纤维蛋白凝块。因此，FXA最终可促使血管破损处的凝血酶形成，促进出血部位血小板聚集。

此外，凝血因子X的活化与肿瘤细胞的迁移有关。肿瘤细胞中含有一种蛋白可以直接把凝血因子X活化为Xa，这种行为会导致凝血纤维蛋白附着在肿瘤细胞表面上，使得肿瘤细胞在体内容易扩散。肿瘤细胞中的这类蛋白极难获得，FXA可以模拟这种蛋白活化凝血因子X，这对肿瘤迁移机理有一定的意义。

目前，主要采用底物法测定FXA的活性，根据作用底物的不同可将测定方法分为两大类：第一大类为天然底物法，即以人血浆为底物，通过判断FXA的加入导致其发生凝固的时间来进行FXA活性测定，该法在20世纪80年代初得到普遍应用，方法常规，但需目测判断纤维蛋白原凝固时间，受检测者主观干扰较大；另一大类为通过FXA水解生色底物产生有特征吸收的生色产物来进行活性测定。但目前多采用两步法测定，即在FXA作用于凝血因子X一段时间后加入终止剂，同时加入生色底物，根据特定时间内Xa的生成量计算FXA的活性。此方法不能排除在活化的早期阶段时间和Xa生成量之间可能存在非线性关系，因而不能精确地反映酶的活性作用特点。

鉴于上述方法的局限性，寻找一种高效、经济的活性测定方法成为磷脂依赖性凝血因子X激活物应用研究的关键之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、可靠、准确地检测磷脂依赖性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法。

本发明中的FXA能够将Human Factor X转换成有水解酶活性的Xa因子(Factor Xa)，Xa因子可切开其生色底物S-2765(Suc-Ile-Gly(γ-Pip)Gly-Arg-PNA)中的肽键，释放出在405nm波长处有特定吸光值的黄色产物对硝基苯胺(PNA)，通过检测405nm处PNA的吸光度，即可对FXA的酶活性进行测定，在这一波长下，其它物质对光的吸收小于PNA对光吸收的1％。随着酶活性梯度变化，吸光度也呈现梯度变化，在一定时间内，反应产物吸光度与酶活线性相关。据此可绘制FXA标准曲线并计算待测样品的酶活性。该方法包括以下步骤：

(1)配制pH＝7.4，浓度为0.02M的Tris-HCl缓冲液；

(2)配制浓度为0.075M的CaCl₂溶液；