[发明专利]八角有效成分的连续分级分离纯化方法

权利要求书

1.八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

1)八角茴香油提取：将八角粉碎后，输送到提取罐，用水蒸气蒸馏法提取八角茴香油；

2)八角油树脂萃取：将有机溶剂与步骤1)得到的八角茴香油输送到固液-液连续萃取器，进行有机固液-液多级逆流连续萃取后，再进行反相萃取，然后用薄膜蒸发器浓缩蒸发回收溶剂，得到的浓缩物即为八角油树脂产品；

3)茴香脑和茴香醛分离：对步骤2)获得的八角油树脂产品进行二级蒸馏，得到茴香脑和茴香醛；

4)莽草酸微生物转化：在步骤1)水蒸气蒸馏法提取八角茴香油后得到的八角渣中加入莽草酸诱导剂，培养，使莽草酸类似物转化为莽草酸；

5)莽草酸提取分离：将步骤4)微生物转化后的八角渣加入水提取或萃取，再采用单一洗脱溶剂乙酸乙酯进行洗脱，结晶先采用甲醇溶剂溶解再用水混合，然后重结晶得到纯度98％以上的莽草酸。

2.如权利要求1所述的八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于在步骤1)中，所述八角的枝叶原料与水的质量比为1∶2，或八角的干果原料与水的质量比为1∶6。

3.如权利要求1所述的八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于在步骤2)中，所述有机溶剂为乙醇，所述乙醇的浓度为85％～95％，pH值为6～7；所述连续萃取的时间为3～4h。

4.如权利要求1所述的八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于在步骤3)中，所述二级蒸馏的具体条件为：第一级蒸馏的温度55～60℃，压力2～4kPa，进料流速1滴/s，刮膜转速300～320r/min，冷凝温度20℃；第二级蒸馏温度45～50℃，压力60～70Pa，进料流速1滴/s，刮膜转速300～350r/min，冷凝温度20℃。

5.如权利要求1所述的八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于在步骤4)中，所述莽草酸诱导剂采用产莽草酸的八角内生菌。

6.如权利要求5所述的八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于所述产莽草酸的八角内生菌的具体方法如下：

A、产莽草酸的八角内生菌的分离：

①对八角进行表面升汞灭菌，接种八角组织块与固体MS培养基上，培养10～15天，并接种数次；

②对八角产生的愈伤组织进行观察，发现其中愈伤组织仍有微生物生长，对其中微生物进行分离；

③对分离出来的微生物进行逐个分离，纯化；

④经过分离，筛选和检测，找到产生莽草酸微生物，为革兰氏阴性细菌；

B、产莽草酸的八角内生菌的培养：

①取牛肉膏10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，混合，有蒸馏水定容至1000ml，121℃高温灭菌20min，制得蛋白胨牛肉膏培养液；

②产莽草酸的八角内生菌在牛肉膏蛋白胨培养液中进行培养，最佳培养液条件为：10g葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培养液，培养温度30℃，pH值7.0；培养基装量50ml/300ml，接种量2％(v∶v)，0.5mg/LMgCl₂牛肉膏蛋白胨培养液，200r/min振荡，时间10～48h。

7.如权利要求1所述的八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于在步骤4)中，所述培养的温度为30～35℃，培养的时间为10～48h。

8.如权利要求1所述的八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于在步骤5)中，所述微生物转化后的八角渣与水的质量比为1∶12～20。

9.如权利要求1所述的八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于在步骤5)中，所述提取采用超声提取2次，每次提取时间为30～40min，温度55～65℃，功率为110～150W。

10.如权利要求1所述的八角有效成分的连续分级分离纯化方法，其特征在于在步骤5)中，所述萃取采用加热萃取，加热萃取的温度为70～80℃，加热萃取的时间为90～100min；所述洗脱的时间为150min。