[发明专利]选择适配体的方法

说明书

本申请是申请日为2008年10月22日，申请号为200880112854.1(国际申请号为PCT/GB2008/003581)，名称为“选择适配体的方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及适配体(aptamer)领域。具体地，本发明涉及产生适配体文库和用于蛋白质组学的蛋白质-特异性适配体的方法，如蛋白质生物标志物鉴定。

背景技术

适配体是短的聚合物，通常为核酸(DNA、RNA、PNA)，其形成明确的三维形状，使它们可以结合靶分子，其结合方式在概念上与抗体相似。适配体组合了小分子和抗体的最优性质，包括高特异性和亲和性、化学稳定性、低免疫原性，和靶向蛋白质-蛋白质相互作用的能力。除了高特异性之外，适配体与它们的靶物之间具有非常高的亲和性。通常，针对蛋白质产生的适配体在皮摩尔至低纳摩尔范围内有亲和性。与单克隆抗体相反，适配体由化学合成，而不是生物表达，提供显著的成本优势(8，9)。

适配体通常通过称为“通过指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)”(SELEX)的体外进化过程产生，所述过程在美国申请No.07/536,428、美国专利No.5,475,096和美国专利No.5,270,163中描述。SELEX过程包括从候选寡核苷酸的混合物选择，和结合、区分与扩增的逐步迭代(iteration)，使用同样常用的选择方案进行，以实际上实现任何期望标准的结合亲和性和选择性。从核酸混合物开始，优选包括随机化序列的区段，SELEX过程包括下述步骤：在有利于结合的条件下用混合物接触靶物，从已经与靶分子特异性结合的那些核酸中区分出未结合核酸，离解核酸-靶物复合物，扩增从核酸-靶物复合物离解的核酸以获得富含配体的核酸混合物，然后重复结合、区分、离解和扩增的步骤，按需要进行多次循环，从而获得仅对靶物分子具有最高结合亲和性的序列。候选寡核苷酸可以包括序列中固定或已知的基序。如果使用完全随机的序列，候选群体中选择性适配体的发现将完全依赖于机遇。实际上，寡核苷酸序列越随机，必须依赖于序列对于研究中靶物的选择性的可能性就越大(11，12，13)。

对于最基本的形式，SELEX过程可以通过下述系列步骤限定：

1)制备不同序列的核酸的候选混合物。候选混合物通常包括固定序列的区域(即，每个候选混合物的成员在相同位置包含相同序列)和随机化序列的区域。选择固定序列区域以：(a)辅助下述扩增步骤，(b)模拟已知可结合靶物的序列，或(c)增加候选混合物中核酸的指定结构排列的浓度。随机化序列可以是全部随机化的(即，在任何位置找到某个碱基的可能性是四分之一)或者仅是部分随机化的(例如，可以选择在任何位置找到某个碱基的可能性为0-100％的任何水平)。

2)在有利于于靶物和候选混合物成员之间结合的条件下将候选混合物与选择的靶物接触。在这种环境中，靶物和候选混合物的核酸之间的相互作用可以认为是在靶物和对于靶物具有最强亲和性的那些核酸之间形成核酸-靶物对。

3)将对于靶物具有最高亲和性的核酸从那些对于靶物具有较低亲和性的核酸中区分出来。因为在候选混合物中只存在极少量对应于最高亲和性核酸的序列(并且可能只有一个分子的核酸)，所以通常理想的是设定区分标准，使区分过程中保留候选混合物中大量的核酸(约5-50％)。

4)然后扩增在区分过程中由于对靶物具有相对较高亲和性而选择的那些核酸，以产生新的候选混合物，其富含对于靶物具有相对较高亲和性的核酸。

5)通过重复上面的区分和扩增步骤，新形成的候选混合物包含的弱结合序列越来越少，并且核酸与靶物的平均亲和性程度将逐渐增加。考虑极端情况，SELEX过程将产生包含一个或少量唯一核酸的候选混合物，所述核酸代表来自对靶物分子具有最高亲和性的原始候选混合物的那些核酸(11，13)。

在产生适配体文库时一个主要的问题是可能的搜索空间的绝对尺度(sheer size)。例如，可以有上百或上千的可能的寡核苷酸序列，其可以对于单个蛋白质具有选择性和特异性，但是人们从何处开始寻找最佳序列呢？