[发明专利]由甘油发酵合成1,3-二羟基丙酮的方法

说明书

技术领域：本发明属于生物有机合成技术领域，涉及1，3-二羟基丙酮的生物有机合成方法。 

背景技术

1，3-二羟基丙酮一种重要的化工、生化原料，医药、农药合成中间体和多功能食品添加剂，用途十分广泛。二羟基丙酮的合成方法主要有贵重金属催化氧化法和微生物法。重金属催化氧化甘油的合成法，由于无法克服催化选择性差的致命缺点，致使甘油转化率低于40％，DHA的产率低于25％。工业生产方法目前是利用微生物分批发酵。该法是在菌体生长到适当的时期，利用菌体产生的脱氢酶以甘油为底物进行脱氢反应，产生DHA。用于生产DHA的微生物主要是醋酸杆菌属(Acetobacter)和葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)微生物，尤其是弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter Suboxy-dans)和氧化葡萄糖杆菌(Gluoonobacter 0xydans)。菌种在复苏后先进行预培养，然后转发酵罐扩大培养，待菌种达到一定浓度后，接种到含有甘油的发酵培养基当中，经过60-80h的耗氧发酵后，再将发酵液一次放出，经分离纯化得到DHA。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。目前已有采用分流加甘油方法，在菌体生长到对数期时，并在产物DHA达到一定水平后，放出部分产物，并补加原料和培养基，这样就可以减少达到生产水平的生物量的时间，提高底物甘油的利用率，节约成本。分批发酵的特点是微生物所处的环境是不断变化的，发生杂菌污染，能够很容易终止操作。在发酵生产中，使用的菌种处于对数生长期，把它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现调整期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩短生产周期。但该法的主要问题是底物甘油和产物DHA在培养基中的浓度过高时产生了高渗透压，使得发酵菌体裂解、失活，从而导致DHA的产率难以提高。本发明是将从酸性土壤分离和筛选的地衣芽孢杆菌B-05571，使用基因重组和DNA重排技术，将脱氢酶基因整合进大肠杆菌J M 109，构建甘油脱氢合成1，3-二羟基丙酮的工业工程菌，并采用超分子自组装模板固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3-二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1，3-二羟基丙酮。合成工艺路线简捷，既节能又环保，所获得的产品质量高和成本低，总质量收率达到75％以上。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成由甘油发酵合成1，3-二羟基丙酮的方法，是将从酸性土壤分离和筛选的地衣芽孢杆菌B-05571，使用基因重组和DNA重排技术，将脱氢酶基因整合进大肠杆菌J M 109，构建甘油脱氢合成1，3-二羟基丙酮的工业工程菌，并采用超分子自组装模板固定化，然后在含有甘油的培养基中发酵合成1，3-二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1，3-二羟基丙酮。 

本发明通过下述方法实现的： 

地衣芽孢杆菌分离培养基：蒸馏水1000mL，甘油5g，NaCl 5g，酵母粉5g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，调pH7.0，0.1MPa灭菌20min.冷却至35℃～45℃，加入尼尔红(Nile Red)2mL/L(0.30mg Nile Red溶于100mL二甲基亚砜)，无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。 

富营养培养基：蒸馏水1000mL，酵母粉10g，琼脂粉10g，甘油3g，(NH₄)₂SO₄5g，调pH7.0，0.1MPa灭菌10min. 

产品发酵培养基： 

磷酸盐缓冲液的配制：蒸馏水1000mL，NaH₂PO₄.12H₂O 8.95g，KH₂PO₄1.5g，pH7.00.1MPa灭菌，15min～20min，备用。 

基因工程菌富集培养基为LB培养基：发酵培养基为添加15.0％甘油的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为35℃。 

地衣芽孢杆菌B-05571发酵及DHA的提取：