[发明专利]一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒

权利要求书

1.一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，包括：

(1)TB稀释液：为含RNase抑制剂的灭菌DEPC水溶液；

(2)TB反应液：为含dNTPs和NTPs扩增所需组份，具体包含Tris 10～50mM，MgCl₂10～40mM，dNTP 0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM；

(3)TB检测液：为恒温扩增时必需的TB引物和TB荧光探针溶解在TE溶液中配制而成，其中TB检测液中的引物和探针包含有以下一对或几对序列：

TB T7：aatttaatac gactcactat agggagacac caacaagctg ataggccgcg g

       aatttaatac gactcactat agggagagtc accccaccaa caagctgata ggc

       aatttaatac gactcactat agggagagta ggccgtcacc ccaccaacaa gc

       aatttaatac gactcactat agggagatca ccccaccaac aagctgatag gc

       aatttaatac gactcactat agggagagta ggccgtcacc ccaccaacaa gctgat

TBnT7：gagtggcgaa cgggtgagta ac

       gcaagtcgaa cggaaaggtc tc

       cgggtgagta acacgtgggt gatctgc

       ctgggaaact gggtctaata c

       gtggcgaacg ggtgagtaac

TB Probe：cguccggaua ggaccacggg acg

          ccacggauag gaccacggga ugcgugg

          ccaggaugca ugucuugugg ccugg；

(4)SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7 RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mMTris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20％ v/v Triton X-100、10～40％ v/v glycerol；

(5)TB阳性对照；为含10²～10⁵CFU/ml结核分枝杆菌的菌液；

(6)TB阴性对照：为不含有SEQ.ID.NO14核酸序列或不含有结核分枝杆菌的的溶液。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述(1)中的稀释液液中RNase抑制剂的浓度为0.1～1％，其余成分为灭菌DEPC水。

3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述(3)中的TB检测液中TB荧光探针为分子信标，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎。

4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(3)中的TB检测液中TB引物为5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物，下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物序列与靶标完全一致。

5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(3)中的引物探针序列选自长516bp TB 16S rRNA基因，序列见序列表SEQ.ID.NO14。

6.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的TB阳性对照和TB临界弱阳性对照中结核分枝杆菌菌液，制备方法包括下列步骤：

(1)将H37Ra标准菌株扩大培养；

(2)采用细菌计数法对培养的菌液进行计数；

(3)将计数的培养物用TB稀释液稀释成阳性对照，所含菌液浓度为10²～10⁵CFU/ml；

TB阳性对照用TB稀释液稀释100倍即为TB临界弱阳性对照，所含菌液浓度为1～10³CFU/ml。