[发明专利]一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及核分枝杆菌TB体外分子生物法检测领域，特别是涉及一种利用RNA恒温扩增的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌(M.Tuberculosis，TB)是人及动物结核病(tuberculosis)的病原菌，属于放射菌目分枝杆菌科分枝杆菌属。可以分为人型、牛型、鸟型、鼠型、冷血动物型和近年来发现的非洲型。对人类致病的主要为人型，牛型杆菌较少见，鸟类杆菌更少见，非典型分枝杆菌也可引起类似结核样病变，但少见。前三型由于发现的较早，已经在1901年伦敦国际结核病会议以后得到完全确认，被称为经典结核杆菌。对人畜威胁最大的正式经典结核杆菌。结核杆菌为细长或微弯曲的杆菌，长1～4μm，宽0.2～0.5μm，呈单个或分枝状排列，无荚膜、无鞭毛、无芽胞。在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状、串球状、短棒状、长丝型。牛型菌比人型菌较短而粗。禽型菌具有多型性，有时呈杆状或链球状等。结核杆菌为专性需氧菌。营养要求高，在含有蛋黄、马铃薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长。生长条件以37～37.5度、pH为6.5～6.8最适合，生长缓慢，在固体培养基上需要2～8周才出现肉眼可以看见的菌落。

目前对结核病诊断主要依靠实验室诊断与临床体症相结合。实验室诊断主要包括涂片检查、培养法、抗原抗体检测、PCR和TMA等。

1.细菌学方法

涂片镜检法：将待检测或者预处理的标本涂于玻片上，固定后进行染色，待干后进行镜检。

抗酸杆菌阴性(-)：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。

抗酸杆菌阳性：

——报告抗酸杆菌菌数：1～8条/300视野

——抗酸杆菌阳性(+)：3～9条/100视野

——抗酸杆菌阳性(++)：1～9条/10视野

——抗酸杆菌阳性(+++)：1～9条/每视野

——抗酸杆菌阳性(++++)：≥10条/每视野

痰涂片直接镜检是检测抗酸杆菌(AFB)最普遍的实验室诊断方法，特异性较高，但灵敏性较低，涂片中分枝杆菌要达到103～104CFU/ml才可检测出阳性结果，且仅能检出1/2-3/4的活动性结核患者，漏检率相当高。

培养法：取消化后的痰液混匀，用无菌吸管接种在培养基斜面，接种后斜面向上于37℃恒温培养箱内，每周观察细菌生长情况，阳性生长者经涂片萋-尼氏染色法验证后随时报告结果，培养至8周仍未见细菌生长者，报告分枝杆菌阴性。

罗氏(Jensen)培养法是目前检测MTB的“金标准”，但其检测周期长(8周)，导致无法及时确诊结核患者，并无法及时治疗。

2.免疫学方法

结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)：结核菌素通常是指旧结核菌素(OT)和结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，常用于结核病流行病学调查、结核菌感染情况监测、卡介苗接种前试验、结核病辅助诊断。MTB在体内感染主要引起细胞介导的免疫反应，一直是筛选结核分枝杆菌潜伏感染的重要方法，已被应用多年，并得到广泛的承认，虽然此方法在世界范围内应用的非常广泛，但是从灵敏度和特异性来说，它不是一个理想的检测方法。为预防结核而接种卡介苗的人群，将会对PPD产生假阳反应。

结核病的免疫学机制主要是机体对结核分枝杆菌所引起的细胞免疫反应。人体初次感染结核分枝杆菌后使T淋巴细胞致敏转化为记忆T淋巴细胞，当人体再次接触结核分枝杆菌后，机体会迅速产生效应T淋巴细胞并产生多种细胞因子发挥免疫效应，其中干扰素(IFN1)是最为关键的细胞因子。因此，检测IFN-y水平或分泌IFN-1的效应T细胞的水平就可以判断是否存在结核感染。

ELISA方法：近年来血清学方法检测结核抗体倍受国内外学者关注。结核诊断尤其是菌阴性结核病诊断仍是结核病防治中亟待研究和解决的问题。目前结核抗体仍是活动性结核病，特别是菌阴性结核病和肺外结核病诊断中的重要辅助诊断手段。由于结核患者免疫功能、遗传背景和接受的治疗不同而导致对MTB抗原识别的差异以及结核患者对抗原的识别存在阶段特异性，目前任何一个单一的抗原或商品化的组合抗原检测试剂盒都无法检测出所有结核患者血清中的抗结核抗体，筛选MTB特异性抗原，组成联合抗原是目前血清学诊断的研究方向。