[发明专利]一种分子改良型凋亡素（30～121）及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，更具体地说，本发明涉及一种分子量经过改良的新型凋亡素。同时，本发明还涉及所述的凋亡素在制药中的应用。 

背景技术

凋亡素(Apoptin or VP3)是来源于鸡贫血病毒(CAV)的一种蛋白，由121个氨基酸组成，相对分子量13600。其能够诱导人肿瘤细胞凋亡，相较其他化疗药物具有以下特点：1.抗肿瘤作用的广谱性，其对全身多种肿瘤细胞均有杀伤作用；2.对肿瘤细胞有选择性杀伤能力，对正常细胞无明显毒副作用；3.诱导肿瘤细胞凋亡不依赖于p53基因的表达，可单独诱导凋亡。4.逃避Bcl-2基因的抗凋亡作用，使其致肿瘤细胞凋亡的作用不受干扰。由于凋亡素具有上述优势，使其近年来受到了研究者的广泛关注，被认为是一种有前景的抗肿瘤备选药物。 

然而，凋亡素作为一种异体来源的大分子病毒蛋白，无疑具有一定的免疫原性，这将导致其在进入人体后可能很快被免疫系统清除，或是诱发剧烈的免疫反应而危及患者。如何克服这些弊端，现有技术中尚无理想的解决办法，严重阻碍了凋亡素的实际应用。 

发明目的 

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的分子改良型凋亡素。 

本发明的另一目的是提供所述凋亡素的制备方法。 

本发明进一步的目的是提供所述凋亡素在制备抗肿瘤药物中的用途。 

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。 

*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。 

本发明中VP3的分子序列，共由121个氨基酸组成，简写为VP3(1-121)。 

分子改良型凋亡素：截除了VP3 N-端的30个氨基酸，简写为VP3(30-121)。 

A.本发明提供了一种分子改良型凋亡素(30～121)，该凋亡素序列具有序列表中SEQ ID № 2所述的氨基酸序列。 

B.本发明还提供了编码上述凋亡素的DNA序列，该DNA序列具有序列表中SEQ ID № 1所述的核苷酸序列。 

C.本发明提供了一种分子改良型凋亡素(30～121)的制备方法，该方法采用以下步骤： 

(1)在本发明前期通过基因拼接法，据NCBI gene bank中VP3基因序列，设计基因合成所用的寡核苷酸序列(Oligo1-Oligo20)及PCR扩增引物(p1、p2)，将Oligo1到Oligo20共20条引物，两两重叠，覆盖整个VP3基因编码区。 

经过磷酸化、退火、连结酶连结后作为模板，利用p1、p2引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃变性3分钟，进入循环，循环条件为94℃变性30秒、55℃退火45秒、72℃延伸1分钟，共35个循环，成功构建出凋亡素VP3(1-121)。经测序验证：经过基因拼接法得到的VP3(1-121)序列与NCBI基因库完全一致，见序列表SEQ ID № 3。 

(2)据VP3的基因序列设计VP3(30-121)的引物，分别为-N端和-C端引物，结合碱基互补配对原则、GC比值和酶切位点等相关因素设计引物序列，并交上海生工合成。将引物与底物VP3(1-121)加入同一PCR体系进行扩增，扩增产物凋亡素VP3(30-121)送测序后验证其序列完全符合NCBI所述。见SEQ ID № 1。 

D.本发明还提供了分子改良型凋亡素VP3(30～121)在制备抗肿瘤药物中的用途。 

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点： 

1.首次对凋亡素进行了最大限度的小型化改造，获得改良型凋亡素(30～121)； 

2.运用PI染色流式细胞仪检测凋亡率，证明改良型凋亡素(30～121)具有和全长凋亡素(1-121)相似的致肿瘤细胞凋亡的能力，并可替代凋亡素(1-121)全长序列作为新型凋亡素用于进一步的实验研究，取得了重大突破； 

3.本发明的研究成果，为实现凋亡素在人体内应用奠定了坚实的基础；本发明提供的分子改良型凋亡素对人体具有更低的免疫原性和更高的安全性，预示着很好的药用前景。 

4.首次通过检测细胞早期凋亡途径中caspas-3蛋白的表达，来验证分子改良型VP3(30-121)对正常细胞无明显影响。 

附图说明

图1是凋亡素的分子功能域； 

图2是凋亡素的蛋白结构域； 

图3是PCR扩增后电泳图，1，2为VP3(30-121)分子量约为276bp；3，4为VP3(1-121)366bp；