[发明专利]高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明是利用基因工程技术构建基因工程菌株，尤其是一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株及其构建方法。

背景技术

普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6-糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的解支酶，在改善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新产品方面有相当巨大的价值，在淀粉加工工业中有着重要的用途及良好的市场前景，目前已经被成熟的应用于高麦芽糖浆、高葡萄糖浆及干啤酒的生产中。

目前，普鲁兰酶的产量很低，只有丹麦诺维信及美国杰能科工业化生产并销售此酶，国内企业均依赖进口，价格昂贵。普鲁兰酶工业化生产菌株较少，我国关于普鲁兰酶的研究主要集中在产普鲁兰酶菌株的筛选、诱变及优化等方面，效果均不太理想，而随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术改造菌种，进一步提高酶的产量及活性，降低生产成本成为可能，并在世界范围内得到越来越广泛的重视及应用。近几年，我国学者特别是江南大学学者利用基因工程技术构建基因工程菌株取得了一定的效果：2006年，夏子芳利用大肠杆菌表达系统表达海栖热袍菌普鲁兰酶基因，并得到少量酶活；2008年，张明焱将来源于Bacillus licheniformis的普鲁兰酶编码基因利用大肠杆菌表达系统表达，酶活力达5.6U/ml；2010年，王淑军等人利用深海古菌Thermococcus siculi HJ21 PCR扩增出一新的普鲁兰酶编码基因，并在大肠杆菌中得到表达，但表达量较低。

我国关于普鲁兰酶的研究起步较晚，为了改变对进口产品的依赖，寻求一条国产化的道路，本发明利用基因工程技术构建基因工程菌株，进一步提高酶的产量及活性，为其工业化生产奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株及其构建方法，通过重新构建后获得基因工程菌的普鲁兰酶的表达量明显提高，为其工业化生产奠定基础。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株含有普鲁兰酶基因，普鲁兰酶基因基因的来源是Bacillus naganoensis(ATCC53909)。

而且，所述基因工程菌株的宿主菌是大肠杆菌BL21(DE3)。

而且，所述基因工程菌株的普鲁兰酶基因由Bacillus naganoensis(ATCC53909)染色体DNA扩增得到的。

一种高效表达普鲁兰酶的基因工程菌株的构建方法，方法的步骤如下：

(1)基因克隆：根据NCBI上报道的基因序列设计引物，以Bacillus naganoensis(ATCC53909)菌株的染色体DNA为模板克隆得到普鲁兰酶基因；

(2)基因工程菌株的构建：将所获得的普鲁兰酶基因与载体pEY-22b(+)连接，酶切验证；

(3)将酶切验证正确的载体转化到宿主E.coli BL21(DE3)内，之后进行酶切，测序验证，确定构建含有普鲁兰酶基因的基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul。

而且，基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul经发酵所测粗酶液酶活力为10.94U/mg，比出发菌株Bacillus naganoensis(ATCC53909)酶活力提高了37倍。

本发明的优点和积极效果如下：

本发明首次利用基因工程技术构建了含有普鲁兰酶基因的工程菌株，本菌株经诱导后获得的粗酶液的酶活力达10.94U/mg，比出发菌株酶活力提高了37倍，实现普鲁兰酶的高效表达，为普鲁兰酶在食品工业中的应用及工业化生产奠定基础。

附图说明

图1为本发明的PCR扩增图，其中：1为PCR产物；2为1kb DNA marker；

图2为本发明重组质粒的构建流程；

图3为本发明酶切验证凝胶图，其中：1为1kb DNA marker；2为经BamH I和Sal I双酶切；3为经BamH I单酶切；4为经BamH I单酶切的pET-22b(+)；

图4为本发明蛋白电泳图，其中1为BL21(DE3)/pET22b-pul诱导前的全细胞；2为BL21(DE3)/pET22b-pul诱导后的全细胞；3为BL21(DE3)诱导前的全细胞；4为BL21(DE3)诱导后的全细胞；5为BL21(DE3)/pET-22b(+)诱导前的全细胞；6为BL21(DE3)/pET-22b(+)诱导后的全细胞；M为蛋白marker。

具体实施方式