[发明专利]一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种改良的农杆菌介导的小麦幼穗转化方法及其应用，属于农业生物技术领域和植物基因工程领域。

背景技术

从20世纪90年代开始，转基因技术在作物遗传改良上的应用成为人们关注的热点。转基因技术能打破物种界限，实现不同物种间基因的转移。

目前常用的小麦转基因方法大体可以分为两大类：一是不依赖于组织培养的转化法，如花粉管通道法、显微注射法等；二是依赖组织培养的转化法，包括基因枪法、农杆菌介导法、电击穿孔法、PEG法等。应用较为广泛的是基因枪法和农杆菌介导法。

小麦遗传转化方法是进行小麦基因功能分析和改良小麦性状的必要手段，目前大多数的转化方法都需要组织培养技术，熟练的操作人员和特殊的设备。

1993年Vasil等通过基因枪将删Gus/bar基因导入小麦品种Pavon中，宣告世界上第一株转基因小麦问世，此后基因枪法一直占据着小麦转基因手段的重要位置。由于受体取材广泛，转化的方法相对也比较成熟，所以基因枪法在植物遗传转化中得到广泛应用。但是由于受小麦基因型、取材的季节性、组织培养的手段等的限制，而且存在转化成本高、嵌合体比率大、转化拷贝数多易造成基因沉默、重组机制并不清楚等诸多问题，在小麦转基因中的应用也受到制约。

农杆菌介导的遗传转化有其独特的价值，一方面它极大地促进人们对植物.微生物相互作用机制的认识；另一方面，由此转移的外源基因多以单拷贝或低拷贝数整合在受体细胞染色体上，有利于其产物的表达和在转基因植株后代中的遗传稳定。通常情况下，转化的对象是植物的原生质体、细胞和组织，再通过离体培养再生植株的试验程序获得转化体。虽然对某些植物这种转化方式十分有效，但步骤上的繁琐、过分依赖组织培养和植株再生技术，限制了它的应用范围，为此建立一些更方便高效的转化方法十分必要。

基因枪转化法是一种DNA的直接转化法，而农杆菌转化法是一种生物转化，具有一定的主动性，且具有基因拷贝数低、发生转基因沉默相对较少、转移的基因片段较长、转化效率高等优点。尽管单子叶植物尤其是禾本科植物曾被认为不在农杆菌天然宿主范围之内，但近几年伴随着农杆菌介导的粳稻遗传转化体系的日趋成熟，表明单子叶植物也是能够被转化的。传统的农杆菌转化法大多采用侵染受体愈伤组织获得转化植株，很大程度上仍然要依赖组织培养和遗传转化的手段。目前研究表明，只有少数基因型材料能通过组织培养再生出大批植株，绝大多数具有重要经济价值的基因型仍难以利用。因此，选择合适的外植体作为农杆菌转化的受体，建立不受基因型限制的转化体系是目前农杆菌转化研究的重点。

小麦是重要的粮食作物，但与水稻和玉米相比，小麦的遗传转化工作进展相对缓慢。小麦组织培养和植株再生技术体系尚不完善，植株再生对基因型依赖性很强，目前只有少数几个品种类型有较高的植株再生频率，大多数优良主栽品种植株再生频率极低，甚至完全不能分化再生植株；经继代的小麦愈伤组织，其生长较为缓慢，无论采用何种选择标记基因和筛选剂对小麦愈伤组织进行筛选都较为困难。因此，若能建立起不依赖植株再生技术的转化方法，将会极大地促进小麦遗传转化工作。

依赖于组织培养的离体转化，必须使用选择标记基因和筛选剂，否则很难保证被转化的细胞正常生长直至最终再生植株。进行活体转化时，选择标记与选择剂仅仅起初步筛选的作用，考虑到目前所用的选择标记的环境与食品安全风险，可以从表达载体中去除选择标记基因，直接采用PCR初步鉴定转化体，这也是活体转化的另一个突出的优点。

何道一等(2003)在小麦开花前的1-2d，将小花颖壳剪去约1/3，再将转化液悬浮的农杆菌滴入小花内。转化后对小麦幼胚和成熟中子分别进行卡那霉素筛选，获得可转化植株。

Janice等(Plant Cell Rep，2009，28：903-913)用处于开花还未露出叶鞘的小穗浸花的方法成功转化了六倍体小麦并能稳定表达外源基因。试验结果表明，不使用组织培养技术的浸花转基因方法，可以获得稳定遗传低拷贝数的转化株，在T5和T6代都观察到了基因的表达。

上述的两种操作方法，均需要进行剪去颖壳或暴露小穗等操作。

发明内容

本发明的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种简便易行的小麦高效转基因方法，其弥补现行小麦转化操作繁琐的不足。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：选择合适的转化时期；含有目的基因农杆菌的活化与重悬；利用小麦的天然生长状态进行幼穗转化；种子的收获及萌发；筛选、移栽及获得转基因植株子代；鉴定转基因植株及分析子代的遗传特性.