[发明专利]提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法

权利要求书

1.提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法，其特征是，该方法包括以下步骤：

（1）选取性能稳定、一致的自然系列安普霉素菌种；

（2）收集原始出发菌种孢子，打碎过滤得到单孢子，分别取0.1ml的单孢子在2×10¹⁴～6×10¹⁴N^＋/cm²的范围内进行不同剂量的N^＋离子注入；然后在15～20W紫外灯下照射30～90S，照射距离25～30cm，进行10³～10⁸倍的稀释，平皿涂布，33-36℃培养5-8天，得到首次复合诱变的单菌落；

（3）将各剂量下首次复合诱变的单菌落挑选50～200个，进行摇瓶发酵；经过一次初筛，1～3次复筛，选出产抗能力提高5%以上的正突变菌种；对选出的正突变菌种进行2～3轮纯化，进行遗传稳定性筛选后得到二次出发菌种；

（4）将二次出发菌种孢子打碎，过滤得到单孢子，然后进行亚硝基胍诱变，诱变剂为pH6.0、浓度为1000-2000μg/ml亚硝基胍溶液，诱变后稀释10³-10⁸倍，平皿涂布，在33-36℃下培养5-8天，得到二次复合诱变单菌落；

（5）将二次复合诱变单菌落80～150个再次进行摇瓶发酵，经过一次初筛，1～4次复筛，选出产抗能力提高5%以上的正突变菌种；对选出的正突变菌种进行2～3轮纯化，进行遗传稳定性筛选后得到三次出发菌种； 

（6）对三次出发菌种进行摇瓶发酵配方的优化和筛选，采用正交试验或者均匀设计试验得到优化的培养基成分为：以重量百分比计，豆饼粉3.0-5.0%，玉米淀粉2.0-2.5%，花生饼粉1.0-2.5%，葡萄糖2.0-5.0%，氯化铵0.1-0.5%，硫酸镁0.2-0.8%，碳酸钙0.3-1.0%，蛋白胨0.5-2.0%，豆油0.5-1.5%，淀粉酶为玉米淀粉量的0.1%，用水定容，消前pH7.2～7.6。

2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述选取性能稳定、一致的自然系列安普霉素菌种是指：对未经诱变的自然系列菌种进行2～3轮纯化，从中挑选摇瓶产抗能力对单菌落进行斜面传代试验，对3～4代斜面产抗能力稳定的菌种进行收集和保藏，作为原始出发菌种。

3.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述离子注入时所用的离子注入机能量为30Kev，脉冲频率为25Hz，真空度为0.3Pa。

4.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述遗传稳定性筛选时的具体方法：对各菌种进行3～4代斜面传代，斜面培养条件为33-36℃培养5-8天，对其中摇瓶产抗能力相对稳定的菌种进行保留。

5.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述摇瓶发酵的培养条件是发酵摇瓶转速为200r/min，在36℃～38℃培养4～6天。

6.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述三次出发菌种经发酵配方筛选后菌种的产抗能力提高8 %以上。

7.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述培养基成分为：豆饼粉4.0-5.0%，玉米淀粉2.0-2.5%，花生饼粉1.0-2.5%，葡萄糖4.0-5.0%，氯化铵0.1-0.5%，硫酸镁0.2-0.5%，碳酸钙0.3-1.0%，蛋白胨0.5-1.0%，豆油0.5-1.5%，淀粉酶为玉米淀粉量的0.1%。