[发明专利]提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌种选育方法，特别是涉及一种提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法。

背景技术

安普霉素是由黑暗链霉菌产生的一种氨基糖苷类抗生素，为国家2000年批准的二类新兽药。该药物对畜禽革兰氏阴性菌和大多数革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性，特别是对耐庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等抗生素的细菌仍有较强的抗菌作用，而且不易产生耐药性，是允许用于食品动物但不需要制定残留限量的药物中的唯一一种抗生素。安普霉素可用于鸡大肠杆菌、沙门氏杆菌和支原体引起的感染，作为药物型饲料添加剂，能促进增重和提高饲料转化率，在畜禽养殖领域得到广泛应用。

针对该药物产生菌产抗性能的提高，目前主要采用物理和化学诱变剂诱变方法。已发表的关于安普霉素菌种诱变文献中，指出诱变剂进行诱变可使安普霉素菌种产抗能力得到一定程度提高，或者推论安普霉素生物合成的途径，但是未涉及运用复合诱变剂来提高菌种产抗能力的方法，也未涉及保持诱变菌种产抗性能长期稳定的选育方法。

鉴于诱变菌种极易产生回复性突变的特性，通过诱变途径得到的产抗性能较高的菌种，产抗性能衰退快，正突变性能不易稳定保持。同时，诱变后的菌种其遗传性状发生改变，原有的营养基质已经不能使其最大发挥产抗能力，还应通过营养基质的调整，优化和筛选来使其产抗性能和潜力得到进一步发挥。        

发明内容

本发明要解决的技术问题：在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法，该方法能使安普菌种产抗性能得到大幅度的提升和长久保持。

本发明技术方案：

提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法，包括以下步骤：

（1）选取性能稳定、一致的自然系列安普霉素菌种；

（2）收集原始出发菌种孢子，打碎过滤得到单孢子，分别取0.1ml的单孢子在2×10¹⁴～6×10¹⁴N^＋/cm²的范围内进行不同剂量的N^＋离子注入；然后在15～20W紫外灯下照射30～90S，照射距离25～30cm，进行10³～10⁸倍的稀释，平皿涂布，33-36℃培养5-8天，得到首次复合诱变的单菌落；

（3）将各剂量下首次复合诱变的单菌落挑选50～200个，进行摇瓶发酵；经过一次初筛，1～3次复筛，选出产抗能力提高5%以上的正突变菌种；对选出的正突变菌种进行2～3轮纯化，进行遗传稳定性筛选后得到二次出发菌种；

（4）将二次出发菌种孢子打碎，过滤得到单孢子，然后进行亚硝基胍诱变，诱变剂为pH6.0、浓度为1000-2000μg/ml亚硝基胍溶液，诱变后稀释10³-10⁸倍，平皿涂布，在33-36℃下培养5-8天，得到二次复合诱变单菌落；

（5）将二次复合诱变单菌落80～150个再次进行摇瓶发酵，经过一次初筛，1～4次复筛，选出产抗能力提高5%以上的正突变菌种；对选出的正突变菌种进行2～3轮纯化，进行遗传稳定性筛选后得到三次出发菌种； 

（6）对三次出发菌种进行摇瓶发酵配方的优化和筛选，采用正交试验或者均匀设计试验得到优化的培养基成分为：以重量百分比计，豆饼粉3.0-5.0%，玉米淀粉2.0-2.5%，花生饼粉1.0-2.5%，葡萄糖2.0-5.0%，氯化铵0.1-0.5%，硫酸镁0.2-0.8%，碳酸钙0.3-1.0%，蛋白胨0.5-2.0%，豆油0.5-1.5%，淀粉酶为玉米淀粉量的0.1%，用水定容，消前pH7.2～7.6。

所述选取性能稳定、一致的自然系列安普霉素菌种是指：对未经诱变的自然系列菌种进行2～3轮纯化，从中挑选摇瓶产抗能力对单菌落进行斜面传代试验，对3～4代斜面产抗能力稳定的菌种进行收集和保藏，作为原始出发菌种。

所述离子注入时所用的离子注入机能量为30Kev，脉冲频率为25Hz，真空度为0.3Pa。

所述遗传稳定性筛选时的具体方法：对各菌种进行3～4代斜面传代，斜面培养条件为33-36℃培养5-8天，对其中摇瓶产抗能力相对稳定的菌种进行保留。

所述摇瓶发酵的培养条件是发酵摇瓶转速为200r/min，在36℃～38℃培养4～6天。

所述三次出发菌种经发酵配方筛选后菌种的产抗能力提高8 %以上。