[发明专利]猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒及制备方法

权利要求书

1.一对用于扩增猪瘟病毒(CSFV)部分E2基因的特异性引物，其特征在于所述引物的序列为：

CSFV上游引物：5’-CGGAATTCGAAGATTACAGGTA TGCGATA-3’

CSFV下游引物：5’-GGCCCTCGAGTTCCACACATGTCCAAT-3’

扩增目的片段大小为550bp。

2.一种用于猪瘟抗体ELISA检测试剂盒包被抗原的制备方法，其特征是用权利要求1所述引物从猪瘟病毒(CSFV)E2基因中扩增包含A、B、C、D共4个中和抗原区：

A中和抗原区的氨基酸序列为：5‘-SVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPFDTSPVVK

GKYNTTLLNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMDCVTTIVENEDL-3’；B中和抗原区的氨基酸序列为：5‘-RLACKEDYRYAIS STDEIGLLGAGGLTTT

WKEYNHDLQLNDGTVKAS CVAGSFK VTALNVVSRRYLASLHKKALPT SVTFELLF-3’；C中和抗原区的氨基酸序列为：5‘-RLACKEDYRYAIS STDEIGLLGAGGLTTTWKEYNHDL

QLNDGTVKASCVAGSFKVTALNVVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFRSGLCPFDTSPVV-3’；D中和抗原区的氨基酸序列为：5‘-SVTFELLFDGTNPSTEEMGD

DFRSGLCPFDTSPVV-3’在内的550bp基因片段，将扩增的E2基因片段克隆到pMD18-T载体上，鉴定正确后，将目的片段进一步定向克隆到PGEX-6P-1原核表达载体，转化BL21表达菌，经IPTG诱导表达，采用亲和层析法从表达产物中分离纯化重组蛋白，免疫印迹检测纯化蛋白的抗原性和特异性。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为PGEX-6p-1高效原核表达载体。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纯化方法采用亲和层析法。

6.一种猪瘟抗体PPA-ELISA检测方法，其特征是以权利要求2-6中任一项的纯化重组蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)为二抗，经过间接ELISA反应条件的优化，建立检测猪瘟抗体的间接ELISA方法。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所用的包被抗原采用权利要求2所述的制备方法制备。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所用的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，并用其对各种猪瘟病毒E2蛋白(A、B、C、D共4个中和抗原区)产生的抗体进行特异性检测。

9.一种猪瘟抗体PPA-ELISA检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中要有：抗原包被板、阳性对照血清、阴性对照血清、10×SPA酶标抗体、10×样品稀释液、20×浓缩洗涤液、底物溶液、终止液、使用说明书。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，用正向间接血凝试验盒(IHA)和IDEXX ELISA试剂盒进行符合率试验。