[发明专利]一种促进切割取样胚胎冷冻解冻后体外发育的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业-畜牧兽医领域，具体地说，涉及一种促进切割取样胚胎冷冻解冻后体外发育的方法。

背景技术

1904年，Spemann将蛙的胚胎进行分割，获得了同胚双生后代，之后研究者分别对小鼠、兔子、羊等动物的不同时期的胚胎进行了分割后培养及移植的实验，至1988年，由张涌教授完成的我国第一个胚胎分割二分胚小鼠在西北农业大学诞生，目前已有猪、马、牛、羊、兔、小鼠、人分割胚后代。随着胚胎生物技术的发展，胚胎分割及胚胎的性别鉴定技术已成为不可缺少的组成部分。胚胎性别鉴定技术推动了胚胎移植的产业化发展，加速了特别是乳畜品种的改良，对现代畜牧业的发展起到了积极的作用。性别鉴定后胚胎的质量由于取样等操作过程的影响而有明显降低，尤其在胚胎冷冻后，其发育潜能会受到较大影响。如何克服这一现象已经成为目前生殖生物学领域研究的热点问题之一。胚胎冷冻尤其是切割取样后胚胎的冷冻，胚胎的透明带、细胞骨架、线粒体的损伤及胚胎数量的减少，使得解冻后极易受到外界环境的氧化应激，降低胚胎的质量，导致胚胎移植的妊娠率大大降低。研究表明，冷冻对胚胎细胞膜的损伤是由自由基引起的。

褪黑素(melatonin，MT)是松果体的主要分泌物，具有良好的水溶性和脂溶性，它可以通过各种膜结构进入细胞器有效地清除细胞代谢中产生的自由基和ROS，另外，MT还可以刺激抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶等的活性，从而有效的降低切割和冷冻使胚胎受到的氧化应激。目前的研究已经证明，褪黑素可以促进羊、猪、牛和小鼠的胚胎的体外发育。冷冻的羊桑椹胚解冻后，在含有1μg/ml褪黑素的培养液中培养24h后，可以获得较高的孵化囊胚率，而且达到孵化末期，胚胎的退化率也较低。10^-9M的褪黑素可以提高猪孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚细胞数，且对胚胎的热应激起到一定的保护作用。对牛体外受精胚胎的体外培养研究表明，在20％氧浓度时，褪黑素可以促进胚胎的体外发育，而不是在7％时，这表明褪黑素有清除氧自由基的能力。Ishizuka等发现，10^-4～10^-6M的褪黑素可以提高小鼠的体外受精率，10^-6～10^-8M的褪黑素支持小鼠早期胚胎的体外发育。

目前有关性别鉴定切割取样后冷冻胚胎的研究主要集中在如何减轻胚胎取样过程和冷冻过程所造成的损伤以及切割后冷冻前短时培养时间的长短上，还没有如何在解冻后复苏培养过程中提高复苏率的研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进切割取样胚胎冷冻解冻后体外发育的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种促进性别鉴定切割取样胚胎冷冻解冻后体外发育的方法，其是将切割取细胞样后的胚胎冷冻解冻进行性别鉴定后在含褪黑素的培养液中进行体外培养；其中，所述培养液为CR1aa液，培养液中褪黑素的浓度为10^-9～10^-3mol/L，优选为10^-7～10^-3mol/L，更优选为10^-3mol/L。

其中，性别鉴定的步骤为：以切取的胚胎细胞样品为模板，利用巢式PCR反应进行扩增，电泳检测PCR扩增产物，根据样品扩增结果来鉴定胚胎的性别。

优选地，PCR扩增使用的引物为：

引物1：5′-TGATAGTTGATCCCACAGAAGG-3′，

5′-TGAACTTACAAGCAGCTGAGG-3′，

引物2：5′-TGAGGCATGGAACTCCGCTTG-3′，

5′-GGTGGTTCCACATTCCGTAGG-3′。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；53℃退火25s；72℃延伸30s，共进行30个循环；最后在72℃延伸5min。

前述的方法，培养时间为2.5～3h。

前述的方法，所述胚胎细胞来源于牛胚胎。优选来源于切割取样后的牛囊胚。

本发明的优点在于：

(1)本发明方法能够提高胚胎切割取样冷冻后体外发育的能力，减轻了切割及冷冻对胚胎的损伤，大大提高了胚胎的利用效率。另外胚胎的孵化率增加，可以增加胚胎移植后的附植率，从而增加性别鉴定后胚胎的利用效率，增加经济及社会效益。

(2)本发明方法中的褪黑素(MT)能够提高切割取样后冷冻的牛体内生产胚胎解冻后复苏能力，从而为提高鉴定胚胎的后续发育潜能和移植的妊娠率提供一定的理论基础。