[发明专利]重组黑曲霉单宁酶及其表达和纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及重组黑曲霉单宁酶及其在大肠杆菌中的表达、纯化，以及重组黑曲霉单宁酶的应用。

背景技术

单宁是植物的次级代谢产物，相对分子质量在500～3000 Da，是一种水溶性聚酚，根据结构和特性，通常分为缩合单宁、复合物单宁和水解单宁三类，也有人将其分为四类，即缩合单宁、复合物单宁、没食子酸单宁和鞣花单宁。单宁广泛存在于植物的根、叶、果实和种子当中。单宁广泛存在于食品和饲料中，是食品尤其是饲料中的主要抗营养因子之一。单宁的抗营养作用主要有三个方面。（1）单宁可以与蛋白质发生多种交联反应，与口腔起润滑作用的糖蛋白结合，形成不溶物，产生涩味，影响动物的食欲；（2）抑制单胃动物体内胰蛋白酶、淀粉酶等多种消化酶的活性，从而降低饲料中营养物质的消化率；（3）与蛋白质形成络合物，影响蛋白质的消化和吸收。单宁与蛋白质复合物（Tannin Protein Complex）在哺乳动物肠道中，难以被蛋白酶等分解，排出体外，增加氮的排泄量。在水溶液清凉茶饮料的生产中，茶中富含的单宁引起茶乳沉淀。单宁与啤酒和果汁中的蛋白质生成沉淀，会引起产品混浊。在食品、饮料、禽畜饲料的生产中必须去除不必要的单宁成分。用单宁酶降解多余的单宁，是一种有广泛应用前景的工艺。

单宁是多种植物性饲料的主要组分，能够抑制许多微生物的生长，抵抗微生物的生物降解。但一些微生物对单宁有抗性，这些微生物通过各种机制和方法降解单宁。Knudson分离到黑曲霉(Aspergillus niger)及青霉(Penicillum sp.)具有降解单宁酸的作用，首次对单宁发酵降解进行研究。之后，单宁降解菌的研究逐步增多，Pourrat等（1987）筛选到一株能分泌单宁酶的黑曲霉，用此菌水解西西里漆树（Rhus coriaria L）中的没食子酸单宁。Oswa等（2000）从人的肠道微生物和食品中首次分离到具有单宁降解功能的乳酸杆菌，分别是植物乳酸杆菌（Lactobacillus palntarum）、类植物乳酸杆菌（Lactobacillus paraplantarum）、戊糖乳酸杆菌（Lactobacillus pentosus）。Bhat等（1996）从采食橡树叶的hill cattle粪便里面，分离到一株能降解单宁-蛋白质复合物的黑曲霉。

单宁酶，也称单宁酰基水解酶（EC3.1.1.20），是一种能够降解水解单宁中酯和缩酚酸之间的链接键，形成没食子酸和葡萄糖。单宁酶是单宁生物降解的关键酶。单宁酶的研究始于20世纪60年代。先后从米曲霉和黑曲霉，念珠菌中分离纯化到单宁酶。也从某些细菌培养液中分离单宁酶。

单宁酶在工业生产中用途广泛，日益受到人们的关注。在食品工业，如茶、啤酒、果汁等制作过程发挥重要作用。在制革工业、化妆品、制药行业也有重要意义。在饲料工业中，添加单宁酶可减少单宁的不良影响，提高饲料的利用率。

发明内容

本发明的一个目的是公开了一种重组黑曲霉单宁酶及其编码基因。

本发明的另一个目的是公开了重组黑曲霉单宁酶的表达及其纯化方法。

本发明的还一个目的是公开了重组黑曲霉单宁酶在工业生产中的应用。

为实现上述目的本发明公开了如下的技术方案：

一种重组表达的黑曲霉单宁酶，其特征在于黑曲霉单宁酶编码的基因核苷酸序列如NO1所示；其所对应的氨基酸序列如NO2所示。

本发明所述黑曲霉单宁酶的表达方法，它是通过表达载体pET32a-Tan在大肠杆菌菌株BL21中采用IPTG进行诱导表达，采用裂解法释放单宁酶后进行纯化得到重组黑曲霉单宁酶。其中所述的纯化为：采用5 mL Ni-NTA柱纯化蛋白，50 mL NPI-10平衡柱子，流速为5 mL/min；加入蛋白粗提物，流速为2 mL/min，50 mL NPI-20洗脱杂蛋白，流速为5 mL/min，30 mL NPI-250洗脱单宁酶蛋白，流速为1 mL/min，收集各步洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。

本发明进一步公开了重组表达的黑曲霉单宁酶，消除植物性饲料中的单宁，降低其其对单胃动物体内胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶的抑制，提高饲料中营养物质的消化率。

本发明所用黑曲霉菌株自主从霉变葡萄中分离得到，该菌株由自主分离得到，菌株由中国科学院微生物研究所鉴定为黑曲霉，相关文章已经发表（《饲料工业》，2011,32(5):28-29，菌种鉴定结果有中国科学院微生物研究所出具的正式报告）。