[发明专利]一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法有效
| 申请号： | 201110143695.5 | 申请日： | 2011-05-31 |
| 公开（公告）号： | CN102229941A | 公开（公告）日： | 2011-11-02 |
| 发明（设计）人： | 唐晓波;李淑珍;单瑞辉;陈莉;李新禹;吴红 | 申请（专利权）人： | 哈尔滨医科大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;G01N33/577;G01N33/574;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 11139 | 代理人： | 孙皓晨 |
| 地址： | 150081 黑龙*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 肝细胞 相关 蛋白 hsp70 表达 纯化 方法 | ||
1.一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)目的基因HSP70的合成；
(2)分别双酶切HSP70基因与载体，连接构建重组质粒，转化宿主菌，构建HSP70基因工程菌；
(3)培养HSP70基因工程菌，诱导表达目的蛋白；
(4)纯化所得融合蛋白；
其中，上述步骤(1)所述的目的基因的合成为：
设计上游引物CGGAATTCCACGGCAAGGTGGAGA
下游引物为CCCTCGAGTTACTGCGAGTCGTTGAAGTA。
从Hela细胞系中提取总RNA进行逆转录后所得cDNA为模板进行PCR反应，PCR扩增条件为：94℃预变性8min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃后延伸8min。
上述步骤(2)所述载体为pET32a及pGEX-4T-1，所用的限制性内切酶为EcoRI和XhoI，所用宿主菌为大肠杆菌。
上述步骤(3)所述的培养工程菌的培养基为LB液体培养基，诱导温度为30℃，诱导时间为4h。
上述步骤(4)所述的纯化方法为将诱导后的菌液分装在离心管中4℃离心，2164g，10min。用PBS缓冲液重悬加入蛋白酶抑制剂(PMSF)后反复冻融8次，进行超声处理至SDS-PAGE显示沉淀中蛋白纯度＞80％。将沉淀最后用6M尿素溶解。
2.如权利要求1所述的表达纯化方法制得的肝细胞癌相关蛋白HSP70的单克隆抗体用作肝细胞癌早期诊断的生物标志物的用途。
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