[发明专利]一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，具体涉及一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法。

背景技术

肝细胞癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，由于早期肝细胞癌不易发现，一旦出现症状，多已到达晚期。因此发现肝细胞癌早期诊断的肿瘤标志物至关重要。有研究报道HSP70基因在早期肝细胞癌中表达阳性率明显高于癌旁组织，并且细胞内HSP70表达增加与肝细胞癌发生、发展有关，且可能是肝细胞癌发展恶化的重要标志(引自1、Wang SM，Ooi LL，Hui KM，et al.Identification and validation of a novel gene signature associated with the recurrence of human hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res，2007，13(21)：6275-6283.；2、Looi KS，Nakayasu ES，Diaz RA，et al.Using proteomic approach to identify tumor-associated antigens as markers in hepatocellular carcinoma[J].J proteome Res，2008，7(9)：4004-4012.)其中HSP70为热休克蛋白的一种，热休克蛋白是一类在生物进化中高度保守，广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质，是生物细胞应激反应的诱导产物。HSP70家族在进化上高度保守，种属间同源性高(引自蒋业贵，王宇明，李奇切.热休克蛋白70在肝细胞癌中的表达及其意义.免疫学杂志，2002；18(1)：64-66)。通过制备肝细胞癌相关蛋白HSP70，可作为抗原免疫小鼠制备相应的单克隆抗体，最终应用于临床作为早期肝细胞癌诊断的生物标志物之一。在实践上拥有巨大的应用潜力，是当前生物医药研究的热点之一。

本发明需要解决的技术问题是通过生物学软件进行分析成功选取HPS70抗原性强的部分设计引物后合成此目的片段后构建重组质粒以及重组蛋白的表达以及纯化方法。

发明内容

本发明的目的在于制备肝细胞癌相关蛋白HSP70作为抗原制备相应的抗体，最终作为早期肝细胞癌诊断的指标，以克服现有技术的不足。

本发明提供了一种肝细胞癌相关蛋白HSP70的表达纯化方法，包括以下步骤：

(1)目的基因HSP70的合成；

(2)分别双酶切HSP70基因与载体，连接构建重组质粒，转化宿主菌，构建HSP70基因工程菌；

(3)培养HSP70基因工程菌，诱导表达目的蛋白；

(4)纯化所得融合蛋白；其中，

上述步骤(1)所述的目的基因的合成为：

设计上游引物CGGAATTCCACGGCAAGGTGGAGA

下游引物为CCCTCGAGTTACTGCGAGTCGTTGAAGTA。

从Hela细胞系中提取总RNA进行逆转录后所得cDNA为模板进行PCR反应，PCR扩增条件为：94℃预变性8min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃后延伸8min。

上述步骤(2)所述载体为pET32a及pGEX-4T-1，所用的限制性内切酶为EcoRI和XhoI，所用宿主菌为大肠杆菌。

上述步骤(3)所述的培养工程菌的培养基为LB液体培养基，诱导温度为30℃，诱导时间为4h。

上述步骤(4)所述的纯化方法为将诱导后的菌液分装在离心管中4℃离心，2164g，10min。用PBS缓冲液重悬加入蛋白酶抑制剂(PMSF)后反复冻融8次，进行超声处理至SDS-PAGE显示沉淀中蛋白纯度＞80％。将沉淀最后用6M尿素溶解。

另一方面，本发明还提供了上述表达纯化方法制得的肝细胞癌相关蛋白HSP70的单克隆抗体用作肝细胞癌早期诊断的生物标志物的用途。