[发明专利]一种结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗及其制备方法无效

专利信息
申请号: 201110144002.4 申请日: 2011-05-31
公开(公告)号: CN102210859A 公开(公告)日: 2011-10-12
发明(设计)人: 井申荣;岳婷婷;曾韦锟;黄芬 申请(专利权)人: 昆明理工大学
主分类号: A61K39/295 分类号: A61K39/295;C12N15/52;C12N15/63;C12N15/70;C12N1/21;C07K19/00;A61P31/06;A61P31/14;A61K39/04;A61K39/155;C12R1/19
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 650093 云*** 国省代码: 云南;53
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摘要:
搜索关键词: 一种 结核 分枝杆菌 esat f2 融合 蛋白 单位 疫苗 及其 制备 方法
【权利要求书】:

1.一种结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗,其特征在于融合蛋白碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所述,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

2.一种权利要求1所述的结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗的制备方法,其特征包括以下具体步骤:

(1)重组亚克隆载体ESAT-6-F2/pMD18T的构建

以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv全基因组为模板,PCR扩增获得ESAT-6基因;以f/pMD18T质粒为模板,PCR扩增获得F2基因,以ESAT-6和F2基因为模板,PCR扩增获得ESAT-6-F2基因,并引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点和6×His标签,扩增产物胶回收纯化后与pMD18T载体连接,获得重组亚克隆载体;ESAT-6-F2基因是由ESAT-6和F2基因以linker连接,碱基序列如SEQ ID NO.1所示;

(2)重组表达载体ESAT-6-F2/pET30a的构建

ESAT-6-F2/pMD18T质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后得到带有粘性末端的目的基因ESAT-6-F2,并与同样双酶切过的表达载体pET30a相连接,形成重组表达载体ESAT-6-F2/pET30a;

(3)重组工程菌的制备

重组表达载体ESAT-6-F2/pET30a,转化到大肠杆菌表达菌株中,得到含ESAT-6-F2基因的重组工程菌;

(4)ESAT-6-F2蛋白的表达

将重组工程菌经过发酵培养,IPTG诱导表达ESAT-6-F2融合蛋白,离心收集菌体破菌,再离心,最后通过金属离子亲和层析纯化法,4℃下,采用梯度透析复性的方法对已纯化好变性蛋白复性即得到ESAT-6-F2融合蛋白;利用纯化的ESAT-6-F2融合蛋白,辅以佐剂,制备结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗。

3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:大肠杆菌表达载体为质粒pET30a及其适用于大肠杆菌系统的pET系列表达载体。

4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:大肠杆菌表达菌株为E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21(DE3) pLys、Origami或Rosetta。

5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:转化大肠杆菌表达菌株的方法为热休克

转化法,电转化法或原生质体转化法。

6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:金属离子亲和层析纯化法为镍离子亲和层析纯化法。

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