[发明专利]一种结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗及其制备方法无效
| 申请号： | 201110144002.4 | 申请日： | 2011-05-31 |
| 公开（公告）号： | CN102210859A | 公开（公告）日： | 2011-10-12 |
| 发明（设计）人： | 井申荣;岳婷婷;曾韦锟;黄芬 | 申请（专利权）人： | 昆明理工大学 |
| 主分类号： | A61K39/295 | 分类号： | A61K39/295;C12N15/52;C12N15/63;C12N15/70;C12N1/21;C07K19/00;A61P31/06;A61P31/14;A61K39/04;A61K39/155;C12R1/19 |
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| 地址： | 650093 云*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 结核 分枝杆菌 esat f2 融合 蛋白 单位 疫苗 及其 制备 方法 | ||
1.一种结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗，其特征在于融合蛋白碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所述，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。
2.一种权利要求1所述的结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征包括以下具体步骤：
（1）重组亚克隆载体ESAT-6-F2/pMD18T的构建
以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv全基因组为模板，PCR扩增获得ESAT-6基因；以f/pMD18T质粒为模板，PCR扩增获得F2基因，以ESAT-6和F2基因为模板，PCR扩增获得ESAT-6-F2基因，并引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点和6×His标签，扩增产物胶回收纯化后与pMD18T载体连接，获得重组亚克隆载体；ESAT-6-F2基因是由ESAT-6和F2基因以linker连接，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）重组表达载体ESAT-6-F2/pET30a的构建
ESAT-6-F2/pMD18T质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后得到带有粘性末端的目的基因ESAT-6-F2，并与同样双酶切过的表达载体pET30a相连接，形成重组表达载体ESAT-6-F2/pET30a；
（3）重组工程菌的制备
重组表达载体ESAT-6-F2/pET30a，转化到大肠杆菌表达菌株中，得到含ESAT-6-F2基因的重组工程菌；
（4）ESAT-6-F2蛋白的表达
将重组工程菌经过发酵培养，IPTG诱导表达ESAT-6-F2融合蛋白，离心收集菌体破菌，再离心，最后通过金属离子亲和层析纯化法，4℃下，采用梯度透析复性的方法对已纯化好变性蛋白复性即得到ESAT-6-F2融合蛋白；利用纯化的ESAT-6-F2融合蛋白，辅以佐剂，制备结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：大肠杆菌表达载体为质粒pET30a及其适用于大肠杆菌系统的pET系列表达载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：大肠杆菌表达菌株为E.coliBL21(DE3)、E.coliBL21(DE3) pLys、Origami或Rosetta。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：转化大肠杆菌表达菌株的方法为热休克
转化法，电转化法或原生质体转化法。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：金属离子亲和层析纯化法为镍离子亲和层析纯化法。
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