[发明专利]一种结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种利用大肠杆菌细胞表达结核分枝杆菌融合蛋白ESAT-6-F2的制备方法。

背景技术

结核分枝杆菌是引发结核病的主要病原菌，可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最常见。随着卫生生活状况的改善和抗结核药物的不断发展，结核病的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)耐药菌株的出现、吸毒、免疫抑制剂的应用、贫困及人口流动因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，全世界约1/3人口感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家，MTB携带率高达80%，其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。近二十年由于艾滋病的流行，HIV病毒破坏了机体的免疫功能，当再次感染MTB时，大大加重艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。因此，结核病成为威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。

目前，预防结核病的唯一疫苗是卡介苗（BCG），但其免疫保护效果极不稳定。同时BCG的接种会对结核病的诊断产生干扰，对于患有免疫缺陷性疾病的人群，接种BCG可能导致致死性感染，因此开发新型更为安全有效的结核病疫苗已成为研究热点。

ESAT-6是结核分枝杆菌的主要分泌蛋白，且在不同的分枝杆菌中均具有较高的同源性。ESAT-6基因长288bp，编码95个氨基酸，理论分子量为9.9kDa，经SDS-PAGE测得其分子量为6kDa，故而得名。ESAT-6蛋白上有两个CD4+T细胞表位，分别位于N端第1-20位氮基酸和第51-60位氨基酸，这两个表位均可被不同单倍体的近交小鼠T细胞识别，当机体再次感染MTB时，可诱发强烈的Th1型免疫反应，产生大量的IFN-γ。ESAT-6上还有两个CD8+T细胞表位，位于第82-90位氨基酸和第69-76位氨基酸，可诱发宿主产生特异性细胞毒性T细胞参与抗结核杆菌感染的免疫反应中。以上证据显示，ESAT-6能被感染结核分枝杆菌的机体细胞所识别，这种识别发生在感染早期阶段，在保护性免疫反应中发挥作用，且能介导持久的免疫记忆。因此ESAT-6可以作为抗结核病疫苗的候选抗原。

RSV是婴幼儿下呼吸道感染的最常见病原体，常引起婴幼儿毛细支气管炎和肺炎，感染呈世界性分布。RSV属于副粘病毒科肺炎病毒属，为单股负链RNA病毒。已经被识别的表面蛋白有10种，其中4种对RSV感染后的免疫起重要作用，分别为F糖蛋白、G糖蛋白、M2基质蛋白和N核蛋白。目前在RSV疫苗的研究中，且同源性较高等优点受到青睐。

F蛋白是一个典型的Ⅰ型糖蛋白，全长574个氨基酸，包含F2区(AA1-109)、裂解多肽(AA110-136) 和F1区(AA137-574)，F1和F2通过二硫键相连接。F1蛋白的疏水性N端负责病毒与靶细胞膜融合，而F2是决定RSV感染宿主细胞特异性的唯一因素。所以F2对于RSV的感染活性具有至关重要的作用。

鉴于ESAT-6蛋白和F2蛋白在激发机体免疫方面的优点，利用基因工程手段，将ESAT-6与F2基因连接，在大肠杆菌中表达ESAT-6-F2融合蛋白，发挥各自的免疫优势，达到免疫平衡效果，同时免疫机体后能够预防结核分支杆菌和呼吸道合胞病毒的感染。

重组融合蛋白中，ESAT-6位于N端，F2位于C端，中间用疏水柔性链接头（linker）连接，从而增加融合蛋白的柔韧性，有利于两种蛋白的正确折叠。linker的基因序列为：GGAGGCTCGGGAGGATCTGGAGGATCGGGAGGA。

因此，本研究将ESAT-6-F2蛋白与ESAT-6蛋白分别免疫小鼠，对两者的免疫原性进行比较，开发一种能够平衡机体体液免疫和细胞免疫的结核分枝杆菌亚单位疫苗。

发明内容

本发明提供一种结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗，旨在发挥ESAT-6蛋白和F2蛋白的免疫优势，达到免疫平衡效果，同时免疫机体后能够预防结核分支杆菌和呼吸道合胞病毒的感染，ESAT-6-F2融合蛋白碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所述，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

本发明另一目的在于提供一种结核分枝杆菌ESAT-6-F2融合蛋白亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

（1）重组亚克隆载体ESAT-6-F2/pMD18T的构建