[发明专利]一种减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法

权利要求书

1.一种减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）鸡γ干扰素chIFN-γ的成熟蛋白的基因序列的扩增；

（2）重组真核表达质粒的获得；

（3）重组真核质粒表达的chIFN-γ活性单位检测；

（4）重组质粒pVAX1^?-chIFN-γ电转化入减毒沙门氏菌获得菌种。

2.根据权利要求1所述的减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，其特征在于：还包括给鸡口服传递chIFN-γ的减毒沙门氏菌后攻毒保护试验：将减毒沙门氏菌培养增殖后给鸡口服，第一天和第二天各口服一次，剂量为10⁸cfu，第3天以50 LD₅₀的新城疫病毒NDV攻毒。

3.根据权利要求1所述的减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1-1）引物的设计及合成；

（1-2）从鸡的脾淋巴细胞提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增出chIFN-γ的成熟蛋白cDNA的PCR产物；

（2）用EcoRI和XhoI双酶切pVAX1^?，胶回收载体片段，与同样经过双酶切并胶回收的chIFN-γ成熟蛋白基因的PCR产物在16oC过夜连接，转化DH5α感受态细菌，筛选出阳性克隆pVAX1^?-chIFN-γ；

（3-1）重组质粒pVAX1^?-chIFN-γ转染HEK-293A细胞；

（3-2）重组质粒pVAX1^?-chIFN-γ表达的chIFN-γ蛋白抗VSV活性检测；

（4）将0.1μg重组真核质粒电转化入减毒沙门氏菌的感受态细胞中，涂布卡那霉素抗性平板，获得减毒沙门氏菌菌株。

4.根据权利要求3所述的减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1-1-1）采用一对扩增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特异性引物，在引物chIFN-γ-Fwd的5’端引入EcoRI酶切位点和Kozak序列,在引物chIFN-γ-Rev的5’端引入XhoI酶切位点，引物序列如下：

chIFN-γ-Fwd: 5’-TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3’

chIFN-γ-Rev: 

5’-GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3’。

5.根据权利要求3所述的减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（3-1-1）将1.0μg重组真核质粒pVAX1^?-chIFN-γ转染HEK-293A细胞，24h后反复冻融细胞转染物3次，12000rpm离心10min，取上清孵育鸡胚成纤维细胞，24h后接毒100TCID₅₀的VSV；

（3-2-1）用VSV检测IFN的活性单位高达1×10^6.0U/0.1ml。