[发明专利]一种减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法

说明书

       

（一）        技术领域

    本发明属于生物技术领域，特别涉及一种减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法。

（二）        背景技术

IFN可分为两个型(I型和II型)，IFN-α、β属于I型干扰素，IFN-γ属于II型干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用。1995年Digby和Lowenthal首次成功地克隆出鸡IFN-γ（chIFN-γ）后，国内外学者通过大肠杆菌、酵母、杆状病毒等表达系统对chIFN-γ做了大量研究。本课题组也曾将chIFN-γ克隆入原核表达载体pET32a中，但是表达的蛋白纯化步骤繁琐、在胃容易被胃酸破坏等缺点。

（三）        发明内容

    本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种对鸡具有明显的抗新城疫病毒（NDV）的减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，它以真核质粒pVAX1^?为载体表达鸡γ干扰素（chIFN-γ）具有很高的抗VSV活性，并将重组质粒电转化入减毒沙门氏菌获得菌种。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）鸡γ干扰素（chIFN-γ）的成熟蛋白的基因序列的扩增；

（2）重组真核表达质粒的获得；

（3）重组真核质粒表达的chIFN-γ活性单位检测；

（4）重组质粒pVAX1^?-chIFN-γ电转化入减毒沙门氏菌获得菌种。

该减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，还包括给鸡口服传递chIFN-γ的减毒沙门氏菌后攻毒保护试验：将减毒沙门氏菌培养增殖后给鸡口服，第一天和第二天各口服一次，剂量为10⁸cfu，第3天以50 LD₅₀的新城疫病毒NDV攻毒。

该减毒沙门氏菌传递鸡γ干扰素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1-1）引物的设计及合成；

（1-1-1）根据GenBank公布的chIFN-γ的基因序列（GenBank no. AY501004）,采用一对扩增chIFN-γ成熟蛋白的基因序列的特异性引物，在引物chIFN-γ-Fwd的5’端引入EcoRI酶切位点和Kozak序列,在引物chIFN-γ-Rev的5’端引入XhoI酶切位点，引物序列如下：

chIFN-γ-Fwd: 5’-TATGAATTCGGTACCACCATGGGACATACTGCAAGTAGT-3’

chIFN-γ-Rev: 

5’-GAGCTCGAGAAGCTTATTAGCAATTGCATCTC-3’；

（1-2）从鸡的脾淋巴细胞提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增出chIFN-γ的成熟蛋白cDNA的PCR产物；

（2）用EcoRI和XhoI双酶切pVAX1^?，胶回收载体片段，与同样经过双酶切并胶回收的chIFN-γ成熟蛋白基因的PCR产物在16oC过夜连接，转化DH5α感受态细菌，筛选出阳性克隆pVAX1^?-chIFN-γ；

（3-1）重组质粒pVAX1^?-chIFN-γ转染HEK-293A细胞；

（3-1-1）将1.0μg重组真核质粒pVAX1^?-chIFN-γ转染HEK-293A细胞，24h后反复冻融细胞转染物3次，12000rpm离心10min，取上清孵育鸡胚成纤维细胞，24h后接毒100TCID₅₀的VSV；

（3-2）重组质粒pVAX1^?-chIFN-γ表达的chIFN-γ蛋白抗VSV活性检测；

（3-2-1）用VSV检测IFN的活性单位高达1×10^6.0U/0.1ml；

（4）将0.1μg重组真核质粒电转化入减毒沙门氏菌的感受态细胞中，涂布卡那霉素抗性平板，获得减毒沙门氏菌菌株。