[发明专利]利用农杆菌对棉花种子胚进行直接转化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用农杆菌对棉花种子胚进行直接转化的方法。

背景技术

自1983年第一例转基因植物问世以来，转基因植物研究已在培育抗病植物、抗虫植物、提高作物品质及产量、提高作物抗逆性等方面发挥了巨大作用。然而目前由于受植物转基因方法、受体材料等限制，利用转基因技术进行植物品质改良受到了一定限制，尤其是对一些难以转化的植物材料如棉花等。目前，利用转基因技术进行棉花新品种培育过程中，存在转化方法繁琐且效率低下，畸形苗发生率高、移栽成活率低等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育转基因棉花的方法。

本发明所提供的培育转基因棉花的方法是通过根癌农杆菌介导将目的DNA转入棉花细胞，该方法包括以下步骤：

1)将含有目的DNA的重组根癌农杆菌接种到已去掉种皮并划伤的棉花种子胚的损伤切面，然后将接种后的棉花种子胚进行共培养使重组根癌农杆菌的T-DNA与棉花的染色体整合；

2)将经过步骤1)共培养的种子胚直接接种于长苗培养基中培养即得到具有根、茎和子叶的幼苗。

所述将含有目的DNA的重组根癌农杆菌接种到已去掉种皮并划伤的棉花种子胚的损伤切面，可按照包括如下步骤的方法进行：将已去掉种皮并划伤的棉花种子胚在所述重组根癌农杆菌菌液中浸泡10～15分钟，如10分钟；所述重组根癌农杆菌菌液的OD₆₀₀为0.3～0.4，如0.3。

所述共培养的时间可为48～72小时，如48小时。

所述共培养的温度可为20～30℃，如25℃。

所述共培养中使用的培养基中含乙酰丁香酮50-200μmol/L，具体可为100-150μmol/L，进一步可为100μmol/L。

所述重组根癌农杆菌菌液中含有乙酰丁香酮50-200μmol/L，具体可为100-150μmol/L，进一步可为100μmol/L。

所述的共培养使用的基础培养基具体可为MS，步骤2)所述的长苗培养基的基础培养基具体可为MS。

所述共培养使用的培养基具体可为50ml/LMS+100μmol/L乙酰丁香酮+2.5g/L植物凝胶，pH：6.5-7.0；所述长苗培养基具体可为50ml/LMS+500mg/L头孢霉素+2.5g/L植物凝胶，pH：6.5。所述共培养使用的培养基和所述长苗培养基的溶剂均为水。

步骤2)所述的长苗培养基中无筛选转化体的选择压力。

所述方法中不包括形成愈伤组织的步骤。

本发明根据植物胚可以发育成长为一个完整植株，并且农杆菌相对于单子叶植物来说更容易侵染双子叶植物等特点，发明了一种以去除种皮并划伤的棉花种子胚为受体，通过与农杆菌共培养，获得转基因植株的方法。本发明从农杆菌侵染之后，在培养基上长出苗就可以直接移栽于田间，不需要漫长的组织培养过程，时间仅需20天左右。而常规农杆菌介导转化方法从侵染开始至再生苗的长出需经过一年的组培过程，而且再生苗的移栽相当困难，目前棉花广泛使用嫁接移栽的方法。本方法对棉花品种不受限制，再生苗直接就可以移栽田间，转化周期短，成本低，移栽成活率高。而常规农杆菌介导转化方法，对受体品种有一定的要求，而且胚胎分化比较困难，漫长的组织培养过程需要投入较高的成本，再生畸形苗发生率高、直接移栽成活率低，严重影响生物技术在棉花遗传转化中的广泛利用。本方法侵染受体是去掉种皮的种子胚，直接对棉花种子胚进行划伤侵染，转化率高。而类似其它方法是对带种皮的种子进行划伤侵染，盲目性大，不容易直接侵染种子胚，所以转化效率不高。

本方法解决了棉花遗传转化中外植体类型的限制，可减少畸形苗发生率，提高移栽成活率，具有操作简便、转化周期短、成本低、转化效率高的优点，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为重组载体pTaNHX2的结构示意图。

图2为转化株叶片生育期卡那霉素标记检测。

图3为移栽到花盆的经过卡那霉素标记检测的转化株。

图4为转基因棉花T₀代的PCR检测。其中，P为pTaNHX2，1-38为T₀代转基因植株，M为分子量标准，箭头表示目的条带。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用基础培养基的MS的组成如下：