[发明专利]一种仔稚鱼快速分类鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种仔稚鱼快速分类鉴定方法。

背景技术

鱼类处于早期发育阶段时形态和生理均会发生显著变化，从而具有明显的阶段性特征，目前得到普遍认可的观点为早期发育阶段包含胚胎期、仔鱼期及稚鱼期，鱼类早期资源调查即以处于这一阶段的鱼类个体为对象进行的资源调查工作。开展鱼类早期资源调查，既能推算鱼类繁殖群体数量，又可以估算补充群体数量，进而科学地预测鱼类种群数量变动，为渔业资源保护和合理开发利用提供科学依据。国内的相关工作进展缓慢，现有的研究主要集中于鱼类早期发育过程中的生理生态研究，关于仔稚鱼区系组成、种群结构以及分布特征等资源层面的生态学研究开展较少。由于早期发育阶段的鱼类个体极小，各种外部形态尚未发生分化，个体间差异很难通过目测加以区分，因此样本分类鉴定工作已经成分制约仔稚鱼生态学研究发展的技术瓶颈。在以往的研究中，为了提高鉴定的准确性，通常采用先对苗种进行短期培育，待形态发生分化后再行鉴定的方法，但在苗种采集量较大、死亡率较高以及调查水域距离较远时，常规方法具有明显的局限性。

发明内容

本发明的目的即为克服常规方法的不足之处，提供一种仔稚鱼快速分类鉴定方法。本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，包括以下步骤：

   （1）在调查水域采集可以准确分类鉴定的鱼类样本，提取样本DNA，通过对特         征片段进行扩增、测序，获得相应序列，从而建立该水域鱼类DNA指纹库；

   （2）在调查水域采集仔稚鱼样本，提取样本DNA，对特征片段进行PCR扩增、测序；

   （3）将获得的仔稚鱼特征片段序列与事先建立的DNA指纹库进行比对，判断仔稚鱼种类。

步骤（1）中所述DNA提取方法为：取背部新鲜肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常规方法抽提DNA，-20℃保存备用。

所述的特征片段为线粒体16S rRNA。

所述特征片段通用扩增引物为：

Forward primer：TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT；

Reverse primer：AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT。

所述的PCR扩增的反应体系为：94℃预变性2分钟；每一循环94℃ 1分钟，57℃ 30秒，72℃ 1分钟；共35个循环，最后72℃延伸8分钟；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用glassmilk纯化试剂盒回收，测序。

本发明在采集仔稚鱼后仅需要用70%的酒精保存，不需要复杂的保存条件，同时选择线粒体16S rRNA这一相对保守的片段为特征片段建立调查水域鱼类DNA指纹库，对仔稚鱼特征片段进行扩增、测序并将序列与DNA指纹库进行比对的方法对调查水域仔稚鱼进行分类鉴定。该方法鉴定准确度高，实验周期短，对样本要求低，克服了现有方法的局限性，显示了其准确、便捷、快速的优势。

具体实施方式

本发明为一种仔稚鱼快速分类鉴定方法，采用以下步骤：

1、在调查水域通过定点捕捞、市场购买等方法获取可以准确分类鉴定的鱼类样本，取背部新鲜肌肉，用70%乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常规方法抽提DNA，-20℃保存备用；

2、选择相对保守的线粒体16S rRNA片段为特征片段，选择通用扩增引物为；Forward primer：TCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT；

Reverse primer：AACCCTTAATAGCGGCTGCACCATT；

3、PCR扩增的反应体系为：94℃预变性2分钟；每一循环94℃ 1分钟，57℃ 30秒，72℃ 1分钟，共35个循环，最后72℃延伸8分钟；

4、PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用glassmilk纯化试剂盒回收，测序；

5、将各鱼类的线粒体16S rRNA片段序列汇总，建立DNA指纹库；

6、在调查水域采集仔稚鱼样本，保存于70%酒精中带回实验室，首先在显微镜或解剖镜下观察，将目测初筛后无法准确辨认的样本编号，按步骤1所述的实验程序分别提取DNA并保存于-20℃冰箱中备用；

7、对制备好的仔稚鱼样本DNA按步骤2-4所述的实验程序，通过扩增、测序获得各个样本线粒体16S rRNA片段序列；

8、将仔稚鱼线粒体16S rRNA片段序列与已经建立的DNA指纹库进行比对，并对仔稚鱼样本进行分类鉴定。