[发明专利]鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及结核和非结核分枝杆菌检测领域，具体涉及检测结核和非结核分枝杆菌的方法及专用试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的非结核分枝杆菌(NTM)引起的疾病称为非结核分枝杆菌病，可累及淋巴结、皮肤、软组织和肺。非结核分枝杆菌感染肺脏，引起肺部病变称为非结核分枝杆菌肺病。其中非结核分枝杆菌(NTM)在世界上报道的有150多种，其中命名了54种，有致病性的分枝杆菌有37种，中国境内分离出了20多种。

NTM是一种环境分枝杆菌，大部分是腐物寄生菌，主要存在于自然环境中，现在普遍被接受的观点是，人可从环境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径，人与人之间传播尚未得到证实，但可以通过动物传染给人。

世界各国由于地理、环境、气候的不同，各国经济、文化水平、医疗技术水平的差异和对疾病的调查方法、标准不同，NTM病流行情况千差万别，但目前几乎是结核病倾向减少，NTM病有逐渐增加趋势。

非结核分枝杆菌致病性特点：

(1)老年人身患多种疾病易发病。非结核分枝杆菌通常作为继发性或伴随性疾病，感染具有机会性是此菌致病性的一个显著特点。往往在慢性阻塞性肺疾病、老年人、恶性肿瘤病人、肾透析、脏器移植时接受免疫抑制剂以及应用肾上腺皮质激素者，本病发生率增加。我们有1例90岁非结核分枝杆菌肺病患者，基础病为慢性阻塞性肺疾病、冠心病、血管性痴呆、前列腺肥大等多种疾病及长期机械通气反复肺部感染。

(2)致病性低。一般认为NTM对人类的致病性比结核分枝杆菌低。刘敬东认为，全国感染NTM者估计在1亿以上，但发病者仅百余例。我病区同时期有9例患者使用呼吸机，其中8例患者从痰中检测到抗酸杆菌，通过结核菌培养加菌种鉴定，其中7例患者无结核复合群。这8例患者中仅1例有明确的肺部阴影。

(3)临床症状差异较大。一般认为NTM引起的肺部病变与肺结核十分相似，症状大多较轻，缺少特征性。一般表现为咳嗽、咳痰、低热和疲乏或偶有咯血，有些患者无明显临床症状和体征。因多数患者有肺部基础疾病，蓁咳嗽、咳痰的症状往往被误诊为基础疾病所致。

(4)艾滋病及HIV感染者多发。在美洲和欧洲艾滋病病人中，发现50％患者感染分枝杆菌，其中10％～15％为鸟-胞内复合群分枝杆菌。

(5)耐药率高。有报道非结核分枝杆菌的耐药率为95.9％。

结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。分枝杆菌感染严重危害着广大人民群众的身体健康，已成为重大的公共卫生问题和社会问题。

1997年我国第一次结核病流行病学抽样调查显示，8省市52万人痰菌培养阳性681份，经菌种鉴定29株为NTM，分离率为4.3％。1990年第三次全国结核病流行病学抽样调查结果显示，NTM感染率为15.35％，浙江省最高为44.89％。2000年全国流调中NTM菌株占11.1％。

当前，我国结核感染防控面临两大问题：一是结核多药耐药(MDR)的产生与传播，使结核分枝杆菌感染难以控制，再度发展为难治倾向，MDR是结核病高病死率的主要原因之一；二是非结核分枝杆菌(NTM)所引发的疾病发病率增加，越来越为人们所关注。由于传统的检测方法需要6到8周才能得到结果，延误了病人的早期治疗，使病人处于盲目用药状态。

大量研究以及临床治疗病例表明多数传统抗痨药对非结核分枝杆菌病(NTM)病很少或没有疗效，因此，对结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的区分检测对指导临床治疗有着重要的意义。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是通过不同分枝杆菌的基因序列的差异来设计荧光探针，进行荧光定量PCR检测，从细菌的基因序列和分子结构水平来区分和鉴定结核和非结核分枝杆菌。

本发明提供的技术方案为提供一种鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，包括对待测菌株进行PCR扩增的引物和荧光定量检测的探针，其特征在于，所述引物为上游引物MF1和下游引物MR1或上游引物MF2和下游引物MR2，所述引物能与分枝杆菌的特异片段结合，所述用于检测分枝杆菌设计的探针1其序列为M1、M2、M3中的任意一个，用于检测结核分枝杆菌设计的探针2序列为T1、T2、T3中的任意一个，所述探针1和探针2的3’端带有淬灭物质，所述探针1和探针2的5’端的荧光物质不同，

所述上游引物MF1的核苷酸序列为序列表中的序列1；

所述下游引物MR1的核苷酸序列为序列表中的序列2；