[发明专利]条件表达猪IκBα基因野生型和突变型的DNA片段

说明书

技术领域

本发明涉及动物基因工程领域，特别涉及一种条件表达猪IκBα基因野生型和突变型的DNA片段。

背景技术

一、IκBα对NFκB信号通路调控及其在延缓性排斥反应中功能的研究进展

NFκB信号通路：通常情况下，NFκB是以同源或异源二聚体形式与IκBα蛋白形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中。当受到外界因素刺激时，IκBα第32，36位丝氨酸残基被IκB蛋白激酶(IKK)磷酸化，磷酸化的IκBα进一步被蛋白酶降解，使NFκB活化，从NFκB-IκBα复合物中解离出并转位于细胞核，与相应的靶基因结合。

NFκB信号通路在机体生长发育过程中具有重要功能，所以不宜在机体生长发育早期就将其阻断。

IκBα对延缓性排斥反应中NFκB信号通路的调控：将IκBα第32、36位丝氨酸突变成丙氨酸，使IκBα不能被IKK磷酸化、降解，从而抑制NFκB的活化。

二、猪异种移植延缓性排斥反应的机理

在异种移植后几天至几周内移植物丧失活性的过程称为延缓性排斥反应(DXR)。

II型内皮细胞激活是以内皮细胞出现新功能为特征，与DXR的发生相关，主要造成两个生理学效应：促炎症反应和促凝血环境的形成，这两种效应都被认为是由NFκB介导的转录激活造成的。因此，目前认为通过对供者器官内皮细胞NF-κB的抑制，从而抑制内皮细胞的活化，是较好的抑制DXR的途径。考虑到IκBα在胚胎、幼年及成年各个时期均具有重要作用，很有必要采用条件性表达技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种条件表达猪IκBα基因野生型和突变型的DNA片段。

本发明提供的表达盒，为双链DNA，自上游至下游依次包括如下元件：启动子、Loxp序列、IκBα蛋白的编码基因、终止序列甲、筛选基因、所述Loxp序列、mIκBα蛋白的编码基因和终止序列乙；所述IκBα蛋白如序列表的序列14所示；所述mIκBα蛋白如序列表的序列15所示。

所述IκBα蛋白的编码基因(猪IκBα基因野生型)可如序列表的序列1自5’末端第741至1817位核苷酸所示(开放阅读框为自5’末端第851至1795位核苷酸)。

所述mIκBα蛋白的编码基因(猪IκBα基因突变型)可如序列表的序列1自5’末端第5125至6201位核苷酸所示(开放阅读框为自5’末端第5235至6179位核苷酸)。。

所述Loxp序列具体可如序列表的序列1自5’末端第700至733位核苷酸(与序列表的序列1自5’末端第5084至5117位核苷酸相同)所示。

所述终止序列甲和所述终止序列乙具体可为序列表的序列1自5’末端第1840至2067位核苷酸(与序列表的序列1自5’末端第6224至6451位核苷酸相同)所示的pA终止序列。

所述启动子具体可为序列表的序列1自5’末端第33至693位核苷酸所示的CMV启动子。

所述筛选基因具体可为序列表的序列1自5’末端第2088至5071位核苷酸所示的TKneo片段的编码基因。

所述表达盒具体可为如下(a)或(b)：

(a)序列表的序列1自5’末端第33至6451位核苷酸所示的DNA；

(b)序列表的序列1所示的DNA。

所述IκBα基因或所述mIκBα基因末端均可添加各种标签(如His、HO、c-myc等)。

含有以上任一所述表达盒的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体的骨架载体可为用于动物的克隆载体或表达载体。

所述重组表达载体具体可为如下(c)或(d)：

(c)在重组质粒pUC19-2的Not I和Cla I酶切位点之间插入所述表达盒得到的重组质粒；所述重组质粒pUC19-2是将酶切识别序列乙插入重组质粒pUC19-1的EcoRI和BamH I酶切位点之间得到的重组质粒；所述重组质粒pUC19-1是将酶切识别序列甲插入pUC19载体的BamH I和HindIII酶切位点之间得到的重组质粒；所述酶切识别序列甲为将序列表的序列7所示的单链DNA和序列表的序列9所示的单链DNA经过变性和退火得到的双链DNA；所述酶切识别序列乙为将序列表的序列10所示的单链DNA和序列表的序列12所示的单链DNA经过变性和退火得到的双链DNA；

(d)在pUC19载体的多克隆位点插入所述表达盒得到的重组质粒。