[发明专利]一种不含基因组DNA的总RNA制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于硅胶柱吸附、纯化不含基因组DNA的总RNA的方法。

背景技术

随着生命科学发展进入到后基因组时代，RNA表达模式的研究受到越来越多的重视。许多有关RNA的检测方法，如逆转录PCR(RT-PCR)，Northern印迹法，基因芯片以及高通量RNA测序技术也日趋广泛应用。获得高质量、完整且不含其它杂质的总RNA，是应用RNA研究技术的前提。当前，提取RNA有很多种方法，主要归为两类。一类是以酚抽提为基础的方法，另一类方法采用固相吸附。现在很多基于硅胶柱的RNA纯化方法都属于这一类。这类纯化方法采用胍盐或其他方法裂解细胞，然后利用在胍盐(硫氰酸胍、盐酸胍等)存在时核酸可与硅胶膜材料结合的性质，将加入胍盐的细胞裂解物转到含有硅胶膜的离心柱上，通过离心使裂解物穿过硅胶膜，并使其中RNA结合在膜上；再使用含乙醇的洗涤液洗涤去除杂质；最后使用低盐溶液或蒸馏水从膜上洗脱纯化的RNA。但由于小分子量的RNA的在胍盐存在时与硅胶膜结合能力较差，这类方法对小分子量的RNA的回收效率较差。

对于现有的方法还存在一个让研究者困扰的问题，即这些方法本身对于基因组DNA的污染的去除能力较差。由于基因组DNA和RNA的理化性质非常类似，通常的RNA提取方法很难将它们彻底分离。一般的硅胶柱法得到的RNA每微克约含600皮克到200纳克的基因组DNA(Agilent公司技术文档)。然而，诸如RT-PCR以及基因芯片技术需要完全不含基因组DNA的RNA样品，以避免由于基因组DNA的可扩增性造成对结果的干扰。基因组DNA的去除可以通过DNA酶I(DNase I)的消化完成。然而用于去除RNA中的DNA所需的DNA酶要求非常高，需要完全不含RNA酶的DNA酶(RNase-free DNase)，否则将导致RNA样品的降解，因此价格非常昂贵。DNA酶消化还大大增加了RNA提取的时间。并且在消化过程中，很难实时监测并控制DNA消化的程度。对于不同批次的样品，酶消化程度的不同可能会造成结果的不确定性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能在纯化步骤中直接去除基因组DNA，而无需DNA酶消化的总RNA制备方法。

本发明解决技术问题的技术方案为：一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，包括以下步骤：

a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；

b)加入与重悬液体积相同的十二烷基硫酸钠溶液，室温裂解3-5分钟，或65度裂解0.5-1分钟；

c)加入酸性醋酸钾溶液，离心，去除出现的沉淀，取上清，醋酸钾和十二烷基硫酸钠溶液摩尔比值为1∶0.9-1.1；

d)将c)步骤所得上清加入酸性醋酸钾溶液，硫氰酸胍贮液，使醋酸钾终浓度为1mol/L，硫氰酸胍为1.5mol/L；离心5-10分钟，取上清；

e)将d)步骤所得的上清加入离心式硅胶柱，离心；收集穿过液，在穿过液中加入无水乙醇，混匀后，-20℃静置10-15分钟，离心10-15分钟，弃上清。

f)将所得RNA沉淀用洗涤液洗涤两次，空气中10-15分钟晾干，然后加入适量超纯水溶解，即可。

所述的重悬液为50±10mmol/L葡萄糖和10±2mmol/L乙二酸四乙酸钠(EDTA)的混合溶液。

所述的生物材料为细菌菌体。菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100μL；

所述的十二烷基硫酸钠溶液液的重量浓度为为2±0.2％。

所述的酸性醋酸钾溶液包含3±0.2mol/L醋酸钾和6.5±0.4mol/L醋酸，pH为5.0±0.05。

所述的硫氰酸胍贮液浓度为4.5±0.1mol/L。

所述的洗涤液为70±5％乙醇，50±5mmol/L醋酸钠，pH 5.2±0.05。

由于单个离心式硅胶柱的吸附量不超过100μg，若上清中基因组DNA含量超过100μg时，可以减少上样量或者采用多个离心式硅胶柱进行吸附。

本发明采用十二烷基硫酸钠作为裂解试剂，裂解细胞后使用醋酸钾和十二烷基硫酸钠反应生成十二烷基硫酸钾(PDS)沉淀，同时共沉淀蛋白质以及大部分基因组DNA。然后利用在硫氰酸胍存在时核酸可与硅胶柱吸附，并且吸附的核酸可按分子量大小利用一定浓度醋酸钾解离的性质，在核酸中加入一定浓度的硫氰酸胍和酸性醋酸钾，采用硅胶柱分离总RNA和残留的基因组DNA。最后采用乙醇沉淀得到总RNA样品。