[发明专利]鉴别冬虫夏草真伪的PCR引物对、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于药材鉴别领域，具体涉及鉴别冬虫夏草真伪的PCR引物对、试剂盒及方法。

背景技术

冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berkeley)Saccardo为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属(Hepialus)幼虫上形成的虫生子囊真菌，为麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草的子座及其寄主鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾的幼虫尸体的复合物，主要分布青藏高原，菌性属于低温型，生长在海拔3,800m的雪线以上，性甘平，补肺益肾，止血化痰，用于久咳虚喘，劳咳咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛，是我国传统的名贵中药材。

由于冬虫夏草具有特殊的药理作用和治疗功效，市场上出现了许多与冬虫夏草形态相似的伪品，其中亚香棒虫草(Cordyceps hawkesii Gray)是最为常见的伪品。亚香棒虫草又称霍克斯虫草，其寄主为鳞翅目蝙蝠蛾科棒蝠蛾属(Napialus)幼虫，分布于湖南、江西、湖北、安徽、浙江、福建、广东等省山区及丘陵低海拔区域。亚香棒虫草与冬虫夏草在形态上相似，常被不法商贩冒充冬虫夏草出售。此外，北虫草Cordyceps militaris(L1)Link，又称蛹虫草也是最为常见的伪品之一。北冬虫夏草，为同属真菌蛹虫草寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫蛹体上的复合物，菌性属中温型，生长在低海拔的平原地域，主要分布在东北、华北、西北等省区，民间用于肺炎、肾虚、腰痛等疾病的治疗。

冬虫夏草由于生长地理的特殊要求，以及严格的寄生性，造成其资源极其稀少，兼之采收的不易更使得野生冬虫夏草显得十分珍贵，价格昂贵。而伪虫草在名称、外形上与之相似，因而常作为冬虫夏草的混淆品出现在药材市场。

因而在本领域需要有一种特异性的检测鉴别冬虫夏草的可靠方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性的检测鉴别冬虫夏草的可靠方法。本发明为了解决上述技术问题所技术方案是提供一种鉴别冬虫夏草真伪的PCR引物对。该鉴别冬虫夏草真伪的PCR(聚合酶链式反应)引物对的序列为：

上游引物(SEQ ID No.1)：5’CAATAAATACCGATACAGGGC 3’；

下游引物(SEQ ID No.2)：5’TGTCTGGACCTGGTGAGTTT 3’。

本发明还提供一种鉴别冬虫夏草真伪的PCR试剂盒。该PCR试剂盒包括从提取的样品DNA中PCR扩增待测样品DNA片段的引物对，包括上述的引物对。当然，该PCR试剂盒还可包括一般的PCR扩增所需的各种标准试剂。优选采用超保真试剂。

本发明另外还提供了一种鉴别冬虫夏草的方法。该方法包括以下步骤：

a、获取样品总DNA；

b、采用上述的引物对在PCR仪上进行PCR扩增；

c、对扩增产物进行测序，并与SEQ ID No.3所示的序列比对，其中的与SEQ ID No.6对应部分100％符合者为真品，否则为伪品。

100％符合者为真品，否则为伪品。

其中，上述方法步骤b所述的PCR扩增的条件为：

其中，上述方法步骤b所述的PCR扩增的体系为：

PCR扩增反应体积为50μl，其中13.6μl ddH₂O，2×Phusion Master mix 25.0μl，7.4μl的5MBetaine，上、下游引物(10μm/L)各1.0μl，DNA模板2.0μl。

为确保PCR扩增时序列的正确性，PCR试剂优选采用超保真试剂：2xPhusion Master Mix(产品编号：F-532L，购自NEB公司)，5M Betaine(产品编号：B 0300)购自sigma公司。

本发明经过充分的前期试验筛选和优化，得到有效的PCR引物对。实验表明，本发明引物对能够有效地扩增冬虫夏草及其常见赝品的目标片段，并且能够准确地鉴别，使用该引物对进行鉴别的方法是特异性的检测鉴别冬虫夏草的可靠方法，具有很好的应用前景。

附图说明

图1、本发明的引物设计示意图，其中有下划线的斜体部分为所设计的引物特异性结合的位置。只有下划线的部分为主要用于比对的579个碱基的区域为可信区间。

图2、使用本发明引物对扩增的玉树冬虫夏草18S片段序列与亚香棒虫草、北虫草18S序列片段比较结果，2-A和2-B的结果是连续的。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施方式对本发明进行具体说明。

实施例一 检测PCR引物的设计与合成及对样品进行检验