[发明专利]模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物

权利要求书

1.模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体，构建方法如下：

1)羊膜的获取

按常规取废弃健康新鲜的胎盘组织，在无菌条件下剥离羊膜，钝性分离绒毛膜，经含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素的PBS浸泡冲洗3×15min，将羊膜切割成3×2cm大小的小片，放入冷冻管中，加入含10％DMSO的PBS，将冷冻管置-80℃冰箱保存备用；

2)羊膜去细胞化处理

取出上述冷冻管，置25℃水浴充分解冻，吸出羊膜中的PBS，再将冷冻管放置于液氮中冷冻，如此解冻和冷冻反复冻融3次，然后将羊膜孵育在1mg/mlDNAase中酶解，37℃条件下孵育3小时伴轻微震荡，室温下离心去除上清液，按常规用PBS充分冲洗羊膜后冻干，成片状羊膜；

3)制备羊膜微载体

将上述片状羊膜迅速置于液氮中，通过均质化冷冻裂解，将片状羊膜裂解成羊膜微粒，然后在真空密闭条件下冷冻干燥，将羊膜微粒依次通过32目、80目金属筛网过滤，获得200-500μm的羊膜微载体。

2.权利要求1所述微载体构建的表皮干细胞皮肤替代物，构建方法如下：

1)培养、扩增表皮干细胞

取术后废弃皮肤，按常规用0.25％Dispase 4℃消化，分离表皮层，用0.25％胰蛋白酶37℃消化20-30分钟，金属筛网过滤，离心收集细胞，将细胞接种于预先铺有IV型胶原的培养皿中，贴壁20min后弃上清，加入无血清培养基K-SFM，隔日换液，当细胞达70％-80％融合时用胰酶消化制备表皮干细胞悬液备用；

2)构建表皮干细胞皮肤替代物

取上述表皮干细胞悬液与权利要求1所述的羊膜微载体按一定比例注入旋转培养系统培养，隔日用无血清培养基K-SFM半量换液，当细胞生长达70％-80％融合时，加入新的羊膜微载体继续扩增表皮干细胞，培养2-3周后形成含表皮干细胞的皮肤替代物。

3.权利要求1所述模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体在构建皮肤替代物中的应用。

4.权利要求2所述皮肤替代物在制备创面修复移植材料中的应用。