[发明专利]模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，是一种可在体外模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及其皮肤替代物。

背景技术

表皮干细胞的培养、扩增一直是皮肤组织工程研究中的热点和难点。目前主要利用表皮干细胞对基底膜的显著黏附特性进行分离、纯化(Barthel R，Aberdam D.Epidermal stem cells.J Eur Acad Dermatol Venereol2005；19(4)：405-13.)，采用二维平面培养的方式进行体外培养与扩增。传代扩增时为了保证干细胞的单一，需要首先将基底膜的主要成份之一IV型胶原平铺于培养皿，但难以避免细胞经多次消化、传代培养后克隆形成率明显下降、逐渐分化、增殖活性降低等缺点，而且由于表皮干细胞固有的慢增殖特性，传统的培养方式难以在较短时间内扩增足量的细胞，无法及时满足应用的需要。

微载体培养是一种大规模扩增贴壁依赖型细胞的技术，提供了细胞单层培养时不具备的三维立体空间，模拟了细胞在体内的生长环境，不仅可以大量扩增细胞，而且有利于维持细胞表型、防止分化，现已广泛应用于生物制药领域。目前研制的微载体多以生物材料人工合成，缺乏基底膜结构，不利于表皮干细胞的粘附、增殖。尽管有人采用表面改良或修饰等仿生技术处理，但仍难以模拟表皮干细胞生长的体内niche微环境，不利于维持其干细胞特性。

研究表明，人羊膜是理想的细胞培养扩增载体(Niknejad H，Peirovi H，Jorjani M，et a1.Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering.Eur Cell Mater 2008；29(15)：88-99.)，具有天然的人体最厚的基底膜，其基本结构与皮肤、角膜基底膜相似，此外基质中含有丰富的生长因子，如NGF、HGF、KGF、bFGF、TGF-β1、EGF等(Koizumi NJ，Inatomi TJ，Sotozono CJ，et al.Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane.Curr Eye Res 2000；20：173-7.)，可以在体外模拟干细胞生长的niche微环境(Grueterich M，Espana EM，Tseng SC.Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cells：amniotic membrane serving as a stem cell niche.Surv Ophthalmol 2003；48(6)：631-46.)，因此羊膜被用于角膜缘干细胞、间充质干细胞的扩增和移植(Shortt AJ，Secker GA，Lomas RJ，et al.The effect of amniotic membrane preparation method on its ability to serve as a substrate for the ex-vivo expansion of limbal epithelial cells.Biomaterials 2009；30(6)：1056-65.Liang HS，Liang P，Xu Y，et al.Denuded human amniotic membrane seeding bone marrow stromal cells as an effective compo site matrix stimulates axonal outgrowth of rat neural cortical cells in vitro.Acta Neurochir(Wien)2009；151(9)：1113-20.)。但至今未见羊膜被制备成模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体以及用其构建表皮干细胞皮肤替代物的报道。

发明内容

本发明提供一种可在体外模拟表皮干细胞生长niche微环境的羊膜微载体及用其构建的表皮干细胞皮肤替代物。

本发明羊膜微载体为具有完整的基底膜结构和生物学活性的三维立体微粒羊膜，以其作为一种天然的新型微载体，结合旋转培养系统，可为表皮干细胞的体外培养扩增提供近似体内的干细胞生长niche微环境，不仅能够短时间迅速扩增表皮干细胞，维持表皮干细胞增殖活性，保持其干细胞特性，而且可直接将其作为真皮支架构建皮肤替代物。