[发明专利]一种快速高效的籼稻转基因方法

权利要求书

1.一种水稻转基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导

将水稻种子接种于诱导培养基中，培养条件为30-33℃，持续光照，培养至种子胚的盾片处诱导出愈伤组织；

(2)载体的选择和农杆菌的准备

将含有目的基因的表达载体转入农杆菌，选取阳性菌株，再将阳性菌株进行培养，然后将培养后的农杆菌震荡悬浮于含有浸染培养基的离心管中，作为愈伤组织的农杆菌浸染液；其中，所述表达载体还含有抗性基因，或者含有抗性基因和红色荧光蛋白基因；

(3)愈伤组织和农杆菌的共培养

将第(1)步诱导出愈伤组织的种子，浸泡于第(2)步得到的农杆菌浸染液，然后将浸染后的种子吸干，置于共培养基上于22-28℃黑暗培养2-5天；

(4)农杆菌的洗脱：洗涤共培养后的种子；

(5)抗性愈伤组织的筛选

首先进行愈伤组织的抗性筛选，将洗脱后的种子置于含有相应筛选剂的筛选培养基上，于30-33℃和持续光照条件下筛选培养10-20天，每7-10天继代一次；若第(2)中的表达载体含有红色荧光蛋白基因，则进一步进行愈伤组织的RFP筛选，将抗性筛选10-20天后的抗性愈伤组织置于绿光激发装置下，透过红色滤光膜筛选含RFP的愈伤组织用于后续的分化培养；

(6)抗性愈伤组织的分化

将筛选出的愈伤组织转移至不含抗生素的分化培养基上，于30-33℃和持续光照条件下进行分化培养10-20天，得到再生植株；

(7)再生植株的生根和二次抗性筛选

若第(5)步中只进行了愈伤组织的抗性筛选，则将再生植株移栽于含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行二次抗性筛选和生根培养5-10天，获得再生苗；若第(5)步中进行了愈伤组织的抗性筛选和RFP筛选，则将再生植株移栽于不含有8筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行生根培养5-10天，获得再生苗；

(8)炼苗和移栽

将再生苗洗去培养基，然后移栽至培养土中，于30-33℃持续光照的培养室中炼苗3-5天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的持续光照强度为80-120μmole m^-2s^-1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第(2)步中，挑取划线培养的农杆菌震荡悬浮于AAM浸染培养基作为愈伤组织的浸染液，其菌液吸光度为OD₆₀₀＝0.05-0.15。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第(2)步中，所述表达载体含有抗性基因和红色荧光蛋白基因；第(5)中，进行愈伤组织的抗性筛选和RFP筛选；第(7)步中，将再生植株移栽于含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行生根培养5-10天。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：所述抗性基因为潮霉素抗性基因或Basta抗性基因，所述红色荧光蛋白基因为AsRed。

6.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：第(1)步培养时间为5-10天。

7.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：所述水稻是籼稻或粳稻。