[发明专利]一种快速高效的籼稻转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因方法，具体而言，涉及一种快速高效的籼稻转基因方法，特指以诱导愈伤组织5-10天的籼稻成熟种子用于农杆菌浸染，并结合后期的快速筛选和分化的籼稻转基因方法，属于生物技术领域。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界主要的粮食作物之一，世界上有将近二分之一的人口是以稻米为主食。尤其是籼稻，其产量占据了世界水稻产量的80％，对全球农业经济具有举足轻重的地位。然而在水稻的生产过程中由于各种病虫害、不良气候与环境的影响，严重制约了水稻的高产、稳产。随着转基因技术的兴起，转基因水稻的研究也成为了各国转基因技术研究的热点。

转基因技术是指将外源基因通过生物、物理或化学手段导入其它生物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的遗传改良体。应用转基因技术将目的基因导入合适的受体获得稳定的转基因植株是转基因的重要环节。在水稻转基因研究上，已开拓建立了多种转基因技术，其中包括以原生质体为受体的聚乙二醇(PEG)转化法、电激法、脂质体转化法，以愈伤组织为受体的基因枪介导转化法和农杆菌介导转化法，以及花粉管通道和种子胚穿刺等in planta转化方法。这些方法适用于不同的受体品种，均取得了一定成效，成功培育了许多高产高抗逆性的转基因水稻。然而这些技术在受体选择、组织培养、转化效率和成本投入等方面还存在各种不同的缺陷，为实验操作带来了诸多不便。

农杆菌介导的转化法利用天然的转化载体系统，遗传稳定性好，且载体可容纳大片段的异源DNA，成为了目前最常用的水稻转基因方法。该方法就是将外源基因插入农杆菌的质粒上，通过愈伤组织与农杆菌的共培养由载体将外源基因转移并整合到水稻细胞基因组中。基本程序包括转化载体的构建、受体愈伤组织的建立、目的基因的转化、抗性愈伤组织的筛选和分化等过程。在传统方法中，即使是较易转化的粳稻也需要3个月，转化效率为30％左右。如果是较难分化的籼稻，其转化时间更长，转化效率更低，甚至有些籼稻品种无法转化成功。究其原因主要是受体愈伤组织建立过程太长，时间近1个月左右，加之后期冗长的筛选和分化过程，使愈伤组织部分丧失了分化活性。更为严重的是，由于长时间的愈伤组织离体培养导致体细胞突变频率显著增加，给后续的转化株系表型鉴定及生化分析带来了不可预知的困难。针对上述问题，通过优化转化流程和参数获得本发明。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种转化时间短、转化效率高、体细胞的突变频率低、操作程序简单的快速高效的水稻转基因方法。

本发明提供的技术方案是：一种水稻转基因的方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导

将水稻种子接种于诱导培养基中，培养条件为30-33℃，持续光照，培养至种子胚的盾片处诱导出愈伤组织；

(2)载体的选择和农杆菌的准备

将含有目的基因的表达载体转入农杆菌，选取阳性菌株，再将阳性菌株进行培养，然后将培养后的农杆菌震荡悬浮于含有浸染培养基的离心管中，作为愈伤组织的农杆菌浸染液；其中，所述表达载体还含有抗性基因，或者含有抗性基因和红色荧光蛋白基因；

(3)愈伤组织和农杆菌的共培养

将第(1)步诱导出愈伤组织的种子，浸泡于第(2)步得到的农杆菌浸染液，然后将浸染后的种子吸干，置于共培养基上于22-28℃黑暗培养2-5天；

(4)农杆菌的洗脱：洗涤共培养后的种子；

(5)抗性愈伤组织的筛选

首先进行愈伤组织的抗性筛选，将洗脱后的种子置于含有相应筛选剂的筛选培养基上，于30-33℃和持续光照条件下筛选培养10-20天，每7-10天继代一次；若第(2)中的表达载体含有红色荧光蛋白基因，则进一步进行愈伤组织的RFP筛选，将抗性筛选10-20天后的抗性愈伤组织置于绿光激发装置下，透过红色滤光膜筛选含RFP的愈伤组织用于后续的分化培养；

(6)抗性愈伤组织的分化

将筛选出的愈伤组织转移至不含抗生素的分化培养基上，于30-33℃和持续光照条件下进行分化培养10-20天，得到再生植株；

(7)再生植株的生根和二次抗性筛选

若第(5)步中只进行了愈伤组织的抗性筛选，则将再生植株移栽于含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行二次抗性筛选和生根培养5-10天，获得再生苗；若第(5)步中进行了愈伤组织的抗性筛选和RFP筛选，则将再生植株移栽于不含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行生根培养5-10天，获得再生苗；

(8)炼苗和移栽