[发明专利]具有谷氨酰胺合成酶功能的基因、其编码蛋白及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有谷氨酰胺合成酶功能的基因、其编码蛋白及其克隆方法。

背景技术

氮素是作物从土壤中吸收量最多的元素，是高等植物必需的营养元素之一。相对于作物对氮素的需求，土壤圈中天然存在的生物有效氮含量通常很低，而提高氮素施用水平对提高作物产量有显著的效应，这促成了氮素化学合成工业的快速发展以及化学合成氮素肥料在农业中大量而广泛的使用。目前，我国已成为世界氮素化肥的第一生产和消费大国，且施用量仍呈每年递增态势。然而，无机氮肥的应用会造成一系列环境问题，尤其是淡水，进而江河和海水的富营养。正因为如此，如今需要降低氮肥的使用量，并寻找氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保证在产量不下降的前提下，减少氮肥的使用量。

对于生物体的生长和发育而言，氮素的同化是个十分重要的生理过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase ,GS)是GS-GOGAT氮同化路径上的关键酶，它和谷氨酸合成酶联合作用，催化NH4⁺同化成谷氨酰胺，而谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，将其酰胺转移到α-酮戊二酸上，从而生成两分子的谷氨酸。谷氨酰胺在生物体内含氮有机物的生物合成中作为氮供体，而外界的无机氮元素也通过这个途径进入生物体内的整个氮素循环。因此谷氨酰胺合成酶在生物体氮同化过程中起到了十分重要的作用。

盐藻(Dunaliella viridis)属于团藻目、多毛藻科、杜氏藻属生物，是耐盐性最强的真核单细胞藻类。不仅可在高盐海水和盐湖等生长，也能经受外界环境中盐浓度0.5-5.5 mol/L剧烈变化。在外界高盐的环境下，盐藻可利用环境中低浓度（毫摩尔）的NO₃^－和NH₄⁺。研究盐藻的氮利用途径，有利于搞清楚高盐环境下植物氮利用途径及调控机制。因此，盐藻谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鉴定对于改善逆境下农作物的性状有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一个具有编码谷氨酰胺合成酶功能的基因。该基因是从盐藻中分离的一个DNA分子，称为DvGS1。

本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供了该基因的克隆方法。

本发明的目的之四在于该基因在提高植株的氮利用率中的应用。

为达以上目的，本发明通过下述方案实现：

一种具有谷氨酰胺合成酶功能的基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO 1 所示的碱基序列。

一种上述的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因的编码蛋白，该蛋白为SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列。

一种上述的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：利用SMART^TM cDNA construction kit构建了3个盐藻cDNA文库，通过对该3个文库中cDNA序列的测序，获得对应的EST文库；再通过序列比对，分离到了一个谷氨酰胺合成酶基因，命名为DvGS1；挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的cDNA序列。

上述的建立3个盐藻cDNA文库的具体步骤为：取液氮冻存的盐藻样品，抽提不同盐藻样品的总RNA，通过甲醛变性电泳检测不同总RNA样品的质量，之后用紫外分光光度计测定混合后总RNA的OD260及OD260/OD280的值,计算总RNA的浓度及纯度；随后采用SMART^TM cDNA library construction kit进行盐藻全长cDNA的合成，接着利用TRIMMER-DIRECT cDNA Normalization Kit对盐藻全长cDNA进行均一化处理；将制备好的pBluescript SK-载体和cDNA片段按1: 5的摩尔比在25 μL体系中 ，于14℃下连接过夜；连接物经脱盐后，进行电激转化；然后，将所有转化物混合，即得到盐藻的全长、均一化cDNA文库。

一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。

一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。

一种上述的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因在低氮环境下提高生物氮利用效率方面的应用。

一种上述的DvGS1基因编码的蛋白在低氮环境下提高生物氮利用效率方面的应用。