[发明专利]一种炎症前期趋化因子拮抗肽及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种炎症前期趋化因子拮抗肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.表达权利要求1所述多肽的噬菌体。

3.一种筛选权利要求1所述多肽的方法，包括以下步骤：

（1）内毒素刺激人外周血单核细胞产生趋化因子，离心收集上清液，分离纯化趋化因子；

（2）噬菌体十二肽库的亲和筛选：以步骤（1）中细胞上清液作为靶标，加入噬菌体十二肽库与靶标结合，酸性洗脱液洗脱，筛选出的噬菌体进行扩增，此筛选步骤进行4轮，第4轮不再扩增，直接保存备用；

（3）对步骤（2）所得噬菌体进行阳性筛选分析，分别进行结合活性分析、竞争抑制分析和趋化因子生成抑制分析，筛选阳性单克隆噬菌体；

（4）阳性单克隆噬菌体DNA的测序及序列分析，获得炎症前期趋化因子拮抗肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（2）所述亲和筛选第1轮将LPS加入到无LPS刺激的人外周血单核细胞培养上清液，包被过夜后加封闭液封闭，洗涤后加入原始肽库溶液，缓慢摇动，收集未结合的噬菌体液；用未结合的噬菌体液加入到经过LPS刺激24h的人外周血单核细胞上清液中，收集洗脱液进行扩增；第2轮用第1轮获得的噬菌体扩增液与经过LPS刺激24h的人外周血单核细胞上清液结合，收集洗脱液扩增；第3轮重复第2轮的步骤，第4轮重复第3轮的步骤，噬菌体洗脱液保存。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述噬菌体十二肽库为美国New England Biolabs公司构建的噬菌体随机十二肽库。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述酸性洗脱液为TBST，且第1轮筛选时TBST中Tween-20 的浓度为0.1％，第2轮筛选时TBST中Tween-20 的浓度为0.3％，第3轮筛选时TBST中Tween-20 的浓度为0.5％。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（2）中第1轮筛选时结合时间 1h，第2轮筛选时结合时间40min，第3轮筛选时结合时间20min，第4轮筛选时结合时间为10分钟；4轮洗脱时间均在10min以内。

8.权利要求1所述炎症前期趋化因子拮抗肽在制备阻断炎症反应药物中的应用。