[发明专利]一种炎症前期趋化因子拮抗肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种炎症前期趋化因子拮抗肽及其制备方法和应用。

背景技术

炎症反应是机体保护自身的正常防御反应，但过度的炎症反应对机体是有害的，会伤害机体自身的组织，严重时甚至会导致多器官衰竭，危及生命。化脓性脑膜炎、全身炎症反应综合症、风湿性关节炎、急性呼吸窘迫症和系统性红斑狼疮等炎症性疾病严重影响了人们的身体健康。

在炎症反应前期,内毒素的主要成分脂多糖可引起血管内皮细胞微丝的降解、促进血液凝固性增强、白细胞在内皮细胞表面黏附等多种途径直接参与或放大炎性反应,是引起休克和炎性反应的关键性介质之一。炎性反应中作为一种重要的炎症介质，趋化因子在炎症的发生发展过程中发挥着重要作用。在炎症反应发展的过程中，机体主要释放IL-8、MCP-1、IL-1、IL-6、RANTES、TNF-a 、SCYA3、SCYB10等炎性因子。

抗炎症反应的研究是近些年来研究的热点之一，主要策略包括: 拮抗细胞因子及相关受体，中和内毒素的抗体，应用LPS启动信号转导的中间分子阻断剂等。采用拮抗细胞因子及相关受体，从而减轻细胞因子对机体的损害，已引起许多学者的关注。

之前绝大多数抗炎治疗的靶点是主要针对募集于局部炎症区域的炎性细胞。研究表明，炎症反应所引起的多种生物学效应往往并非直接作用于靶细胞的结果。细菌内毒素通常首先是激活单核-巨噬细胞系统，诱导其分泌多种介质因子，然后通过这些介质因子在局部或循环中播散至机体其它部分而发挥效应作用。因此，目前的抗炎治疗是致力于抑制特定炎性细胞向炎症区域的迁移，而炎症反应前期产生的炎性介质因子成为主要的治疗靶点。大多数趋化因子在炎症中所扮演的角色是吸引特定的炎症细胞浸润于炎症部位参与炎症反应,其作用的发挥通过与其受体的结合来完成。因此，我们可以通过抑制炎症初期某些趋化因子的活动来减少有害的免疫应答。

目前主要有以下三种类型趋化因子及其受体的拮抗剂：趋化因子受体的小分子抑制剂、抗趋化因子及其受体的中和单克隆抗体、修饰的趋化因子或N-端肽。 

噬菌体展示技术(Phage Display Techniques, PDT) 是近些年来发展起来的一项新型技术，它是探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子，探测未知蛋白空间结构表位的有利工具。其原理是利用基因重组技术，将合成的寡核苷酸或者cDNA插入到丝状噬菌体(M13， fd或f1)主要外壳蛋白gpⅧ或次要外壳蛋白gpⅢ基因的5'端，从而使相应的蛋白质或多肽融合表达于gpⅧ或gpⅢ的N-端，展示于噬菌体的表面。因此，噬菌体展示技术将外源蛋白的基因型与表现型紧密联系在一起，通过“吸附-洗脱一扩增”的亲和筛选过程，可以将展示特异性外源蛋白的噬菌体从表达有各种各样外源蛋白的噬菌体肽库(10⁸-10¹²)中筛选出来，经扩增可以得到上千倍乃至10⁸倍的富集，从而可以很容易地对所筛选到的克隆进行序列测定，确定表达的肽的氨基酸序列。

亲和富集的方法进行噬菌体肽库筛选作为噬菌体肽库筛选的基本过程被一直沿用至今，其流程是：将肽库中各种肽分别展示在各个噬菌体表面，众多重组型噬菌体便组成了噬菌体随机肽库，通过与特定的靶标进行反应，使展示特定多肽的噬菌体牢牢吸附在靶标上，通过大约10~15 次的洗涤把未结合和非特异性吸附的噬菌体洗掉，留下与靶标特异性结合的噬菌体，然后用洗脱的方法把特异性吸附的噬菌体从靶标上洗脱下来，通过感染大肠杆菌使筛选出来的噬菌体得到扩增和富集，然后进行DNA序列测定，获得相应的多肽序列和功能信息，实现了高通量筛选。其步骤一般如下：① 靶分子固定化，一般包被于 96 孔板或连接于固相惰性载体上；②将肽库的噬菌体与靶分子共同孵育，使靶分子与噬菌体肽库液特异性的结合；③ 洗去未结合的噬菌体；④ 采用酸洗脱或拮抗剂竞争性洗脱特异性结合的噬菌体；⑤ 再次感染大肠杆菌扩增阳性噬菌体克隆，进行下一轮筛选，大约经过3~4轮反复“吸附－洗脱－扩增”的筛选，结合目的多肽的噬菌体得到高度富集。最后，则可将表面呈现有高亲和力的特异性多肽的噬菌体从表达有各种的多肽噬菌体肽库中筛选出来。