[发明专利]一种茶碱均相酶免疫检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种茶碱均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

试剂R1：茶碱衍生物特异的多克隆抗体；

试剂R2：葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物；

试剂R3：定标液；

所述定标液为茶碱校准品溶于空白血清中制得；

所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物为茶碱衍生物与葡萄糖六磷酸脱氢酶偶联产物，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物能与茶碱衍生物特异抗体特异性结合；

所述茶碱衍生物特异的多克隆抗体是以茶碱衍生物与牛血清白蛋白偶联的产物为免疫抗原制得。

2.根据权利要求1所述的茶碱均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，所述定标液为6种不同茶碱质量浓度的溶液，所述定标液茶碱质量浓度分别为0.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL。

3.根据权利要求1所述的茶碱均相酶免疫检测试剂盒，其特征在于，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物稀释度为1∶1000-1∶6000，茶碱衍生物特异的多克隆抗体稀释度为1∶400-1∶3000。

4.一种茶碱均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：茶碱衍生物特异的单克隆或多克隆抗体的制备，葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物的制备，定标液的制备。

5.根据权利要求4所述的茶碱均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述茶碱衍生物特异的多克隆抗体的制备包括以下步骤：

步骤a：

将牛血清白蛋白溶解于0.2mol/L的pH为8.5的磷酸缓冲液中；

茶碱衍生物的活化：将特异的茶碱衍生物100mg置于容器中，并依次加入3.5mL二甲基酰胺、3.5mL乙醇、7mL磷酸钾缓冲液、400mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和50mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺；所述磷酸钾缓冲液浓度为10mmol/L，pH值为5.0；

步骤b：茶碱衍生物免疫抗原的偶联和纯化：将步骤a活化的茶碱衍生物滴加到步骤a所得的牛血清白蛋白溶液中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，将偶联的抗原进行孔径为8KD的透析袋透析纯化；

步骤c：采用步骤b得到的茶碱衍生物免疫抗原制备茶碱衍生物抗体。

6.根据权利要求5所述的茶碱均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，

所述步骤c为：

将步骤b合成的茶碱免疫抗原用10mmol/L，pH7.4的磷酸缓冲液稀释至1.0mg/mL，然后用茶碱免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对兔子进行注射，14-21天后，再用相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对兔子注射一次，之后每隔28天注射一次，从兔子进行初次注射开始，经过4个月后获得的抗体。

7.根据权利要求6所述的一种茶碱均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物的制备包括以下步骤：

a、将15mg葡萄糖六磷酸脱氢酶溶解于12mLTris缓冲液中，然后依次加入225mg还原型辅酶I、135mg葡萄糖-6-磷酸、0.75mL卡必醇和2.25mL二甲基亚砜；所述Tris缓冲液pH为9.0，各组分浓度为：0.05mol/LTris、3.3mmol/L氯化镁，145.4mmol/L氯化钠；

b、茶碱衍生物的活化：将特异的茶碱衍生物8.64mg溶解于420μL二甲基亚砜和180μL二甲基酰胺组成的混合溶液中，所述混合溶液加入6μL三丁胺和3μL氯甲酸异丁酯，在2～8℃条件下搅拌30分钟；

c、将所述步骤b所得溶液逐滴加入到步骤a所得溶液中，在2～8℃条件下用磁力搅拌器搅拌60分钟，将所得酶标抗原进行透析纯化，得到葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物。