[发明专利]一种茶碱均相酶免疫检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体涉及一种茶碱均相酶免疫检测试剂盒及其制备方法。 

背景技术

茶碱为甲基黄嘌呤类的衍生物，临床上常用于治疗支气管哮喘、哮喘型慢性支气管炎和心源性哮喘等。但茶碱也具有很多毒副作用，包括：恶心，头痛，腹泻，呕吐，肠胃出血，癫痫以及心律失常等。由于茶碱的有效浓度治疗窗窄(治疗血清浓度参考范围为10-20μg/mL)，且毒副反应发生率与其血药浓度密切相关，因此在治疗期间对病人的茶碱血清浓度水平进行检测非常重要。 

目前测定茶碱血药浓度的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)和荧光偏振免疫分析法(FPIA)。高度自动化的FPIA法因其简便快速成为临床茶碱血药浓度监测最常用的方法，但其试剂盒依赖进口，价格昂贵和有效期较短是其不可回避的缺点。而HPLC法常因操作繁琐，效率低，测定周期长及分析成本高的缺点限制了其在临床药物浓度监测中的广泛应用。 

因此开发一种操作简便、周期短、成本低、灵敏度高的检测方法成为急待解决的问题。 

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、快速、灵敏度高和全自动化的茶碱药物浓度检测试剂盒和制备方法，。 

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种茶碱均相酶免疫检测试剂盒，包括以下组分： 

试剂R1：茶碱衍生物特异的多克隆抗体； 

试剂R2：葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物； 

试剂R3：定标液； 

所述定标液为茶碱校准品溶于空白血清中制得； 

所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物为茶碱衍生物与葡萄糖六磷酸脱氢酶偶联产物，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物能与茶碱衍生物特异抗体特异性结合； 

所述茶碱衍生物特异的多克隆抗体是以茶碱衍生物与牛血清白蛋白偶联的产物为免疫抗原制得。 

优选的，所述定标液为6种不同茶碱质量浓度的溶液，所述定标液茶碱质量浓度分别为0.0μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL。 

优选的，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物稀释度为1∶1000-1∶6000，茶碱衍生物特异的多克隆抗体稀释度为1∶400-1∶3000。 

为了解决上述技术问题，本发明所采用的另一个技术方案是提供一种茶碱均相酶免疫检测试剂盒的制备方法，所述方法包括以下步骤：茶碱衍生物特异的单克隆或多克隆抗体的制备，葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物的制备，定标液的制备。 

优选的，所述茶碱衍生物特异的多克隆抗体的制备包括以下步骤： 

步骤a： 

将牛血清白蛋白溶解于0.2mol/L的pH为8.5的磷酸缓冲液中； 

茶碱衍生物的活化：将特异的茶碱衍生物100mg置于容器中，并依次加入3.5mL二甲基酰胺、3.5mL乙醇、7mL磷酸钾缓冲液、400mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺和50mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺；所述磷酸钾缓冲液浓度为10mmol/L，pH值为5.0； 

步骤b：茶碱衍生物免疫抗原的偶联和纯化：将步骤a活化的茶碱衍生物滴加到步骤a所得的牛血清白蛋白溶液中，在2～8℃条件下搅拌12-16小时，将偶联的抗原进行孔径为8KD的透析袋透析纯化； 

步骤c：采用步骤b得到的茶碱衍生物免疫抗原制备茶碱衍生物抗体。 

优选的，所述步骤c为： 

将步骤b合成的茶碱免疫抗原用10mmol/L，pH7.4的磷酸缓冲液稀释至1.0mg/mL，然后用茶碱免疫抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对兔子 进行注射，14-21天后，再用相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对兔子注射一次，之后每隔28天注射一次，从兔子进行初次注射开始，经过4个月后获得的抗体。 

优选的，所述葡萄糖六磷酸脱氢酶标记的茶碱衍生物的制备包括以下步骤： 

a、将15mg葡萄糖六磷酸脱氢酶溶解于12mLTris缓冲液中，然后依次加入225mg还原型辅酶I、135mg葡萄糖-6-磷酸、0.75mL卡必醇和2.25mL二甲基亚砜；所述Tr i s缓冲液pH为9.0，各组分浓度为：0.05mol/LTris、3.3mmol/L氯化镁，145.4mmol/L氯化钠；